In mammals, the circadian oscillator generates approximately 24-h rhythms in feeding behavior, even under constant environmental conditions. Livers of mice held under constant darkness exhibit circadian rhythm in abundance in up to 15% of expressed transcripts. Therefore, oscillations in hepatic transcripts could be driven by rhythmic food intake or sustained by the hepatic circadian oscillator, or a combination of both. To address this question, we used distinct feeding and fasting paradigms on wild-type (WT) and circadian clock-deficient mice. We monitored temporal patterns of feeding and hepatic transcription. Both food availability and the temporal pattern of feeding determined the repertoire, phase, and amplitude of the circadian transcriptome in WT liver. In the absence of feeding, only a small subset of transcripts continued to express circadian patterns. Conversely, temporally restricted feeding restored rhythmic transcription of hundreds of genes in oscillator-deficient mouse liver. Our findings show that both temporal pattern of food intake and the circadian clock drive rhythmic transcription, thereby highlighting temporal regulation of hepatic transcription as an emergent property of the circadian system.

The circadian clock is a molecular and cellular oscillator found in most mammalian tissues that regulates rhythmic physiology and behavior. Numerous investigations have addressed the contribution of circadian rhythmicity to cellular, organ, and organismal physiology. We recently developed a method to look at transcriptional oscillations with unprecedented precision and accuracy using high-density time sampling. Here, we report a comparison of oscillating transcription from mouse liver, NIH3T3, and U2OS cells. Several surprising observations resulted from this study, including a 100-fold difference in the number of cycling transcripts in autonomous cellular models of the oscillator versus tissues harvested from intact mice. Strikingly, we found two clusters of genes that cycle at the second and third harmonic of circadian rhythmicity in liver, but not cultured cells. Validation experiments show that 12-hour oscillatory transcripts occur in several other peripheral tissues as well including heart, kidney, and lungs. These harmonics are lost ex vivo, as well as under restricted feeding conditions. Taken in sum, these studies illustrate the importance of time sampling with respect to multiple testing, suggest caution in use of autonomous cellular models to study clock output, and demonstrate the existence of harmonics of circadian gene expression in the mouse.

Understanding gene regulation and function requires a genome-wide method capable of capturing both gene expression levels and isoform diversity at the single-cell level. Short-read RNAseq is limited in its ability to resolve complex isoforms because it fails to sequence full-length cDNA copies of RNA molecules. Here, we investigate whether RNAseq using the long-read single-molecule Oxford Nanopore MinION sequencer is able to identify and quantify complex isoforms without sacrificing accurate gene expression quantification. After benchmarking our approach, we analyse individual murine B1a cells using a custom multiplexing strategy. We identify thousands of unannotated transcription start and end sites, as well as hundreds of alternative splicing events in these B1a cells. We also identify hundreds of genes expressed across B1a cells that display multiple complex isoforms, including several B cell-specific surface receptors. Our results show that we can identify and quantify complex isoforms at the single cell level.

Rod/cone photoreceptors of the outer retina and the melanopsin-expressing retinal ganglion cells (mRGCs) of the inner retina mediate non-image forming visual responses including entrainment of the circadian clock to the ambient light, the pupillary light reflex (PLR), and light modulation of activity. Targeted deletion of the melanopsin gene attenuates these adaptive responses with no apparent change in the development and morphology of the mRGCs. Comprehensive identification of mRGCs and knowledge of their specific roles in image-forming and non-image forming photoresponses are currently lacking. We used a Cre-dependent GFP expression strategy in mice to genetically label the mRGCs. This revealed that only a subset of mRGCs express enough immunocytochemically detectable levels of melanopsin. We also used a Cre-inducible diphtheria toxin receptor (iDTR) expression approach to express the DTR in mRGCs. mRGCs develop normally, but can be acutely ablated upon diphtheria toxin administration. The mRGC-ablated mice exhibited normal outer retinal function. However, they completely lacked non-image forming visual responses such as circadian photoentrainment, light modulation of activity, and PLR. These results point to the mRGCs as the site of functional integration of the rod/cone and melanopsin phototransduction pathways and as the primary anatomical site for the divergence of image-forming and non-image forming photoresponses in mammals.

Antibodies that bind to both H1 and H3 influenza strains exist in the pre-vaccination serum repertoire of healthy adults; most vaccine-elicited clonotypes bind either H1 or H3 strains. Molecular understanding of serological immunity to influenza has been confounded by the complexity of the polyclonal antibody response in humans. Here we used high-resolution proteomics analysis of immunoglobulin (referred to as Ig-seq) coupled with high-throughput sequencing of transcripts encoding B cell receptors (BCR-seq) to quantitatively determine the antibody repertoire at the individual clonotype level in the sera of young adults before and after vaccination with trivalent seasonal influenza vaccine. The serum repertoire comprised between 40 and 147 clonotypes that were specific to each of the three monovalent components of the trivalent influenza vaccine, with boosted pre-existing clonotypes accounting for ∼60% of the response. An unexpectedly high fraction of serum antibodies recognized both the H1 and H3 monovalent vaccines. Recombinant versions of these H1 + H3 cross-reactive antibodies showed broad binding to hemagglutinins (HAs) from previously circulating virus strains; several of these antibodies, which were prevalent in the serum of multiple donors, recognized the same conserved epitope in the HA head domain. Although the HA-head-specific H1 + H3 antibodies did not show neutralization activity in vitro, they protected mice against infection with the H1N1 and H3N2 virus strains when administered before or after challenge. Collectively, our data reveal unanticipated insights regarding the serological response to influenza vaccination and raise questions about the added benefits of using a quadrivalent vaccine instead of a trivalent vaccine.

Chromatin structure plays a pivotal role in facilitating proper control of gene expression. Transcription factor (TF) binding of cis-elements is often associated with accessible chromatin regions. Therefore, the ability to identify these accessible regions throughout plant genomes will advance understanding of the relationship between TF binding, chromatin status and the regulation of gene expression. Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (ATAC-seq) is a recently developed technique used to map open chromatin zones in animal genomes. However, in plants, the existence of cell walls, subcellular organelles and the lack of stable cell lines have prevented routine application of this technique. Here, we describe an assay combining ATAC-seq with fluorescence-activated nuclei sorting (FANS) to identify and map open chromatin and TF-binding sites in plant genomes. FANS-ATAC-seq compares favorably with published DNaseI sequencing (DNase-seq) results and it requires less than 50 000 nuclei for accurate identification of accessible genomic regions.Application of ATAC-seq to sorted nuclei identifies accessible regions genome-wide.

In the mouse liver, circadian transcriptional rhythms are necessary for metabolic homeostasis. Whether dynamic epigenomic modifications are associated with transcript oscillations has not been systematically investigated. We found that several antisense RNA, lincRNA, and microRNA transcripts also showed circadian oscillations in adult mouse livers. Robust transcript oscillations often correlated with rhythmic histone modifications in promoters, gene bodies, or enhancers, although promoter DNA methylation levels were relatively stable. Such integrative analyses identified oscillating expression of an antisense transcript (asPer2) to the gene encoding the circadian oscillator component Per2. Robust transcript oscillations often accompanied rhythms in multiple histone modifications and recruitment of multiple chromatin-associated clock components. Coupling of cycling histone modifications with nearby oscillating transcripts thus established a temporal relationship between enhancers, genes, and transcripts on a genome-wide scale in a mammalian liver. The results offer a framework for understanding the dynamics of metabolism, circadian clock, and chromatin modifications involved in metabolic homeostasis.

Annual influenza vaccinations aim to protect against seasonal infections, and vaccine strain compositions are updated every year. This protection is based on antibodies that are produced by either newly activated or memory B cells recalled from previous encounters with influenza vaccination or infection. The extent to which the B-cell repertoire responds to vaccination and recalls antibodies has so far not been analyzed at a genetic level—which is to say, at the level of antibody sequences. Here, we developed a consensus read sequencing approach that incorporates unique barcode labels on each starting RNA molecule. These labels allow one to combine multiple sequencing reads covering the same RNA molecule to reduce the error rate to a desired level, and they also enable accurate quantification of RNA and isotype levels. We validated this approach and analyzed the differential response of the antibody repertoire to live-attenuated or trivalent-inactivated influenza vaccination. Additionally, we analyzed the antibody repertoire in response to repeated yearly vaccinations with trivalent-inactivated influenza vaccination. We found antibody sequences that were present in both years, providing a direct genetic measurement of B-cell recall.

The histone lysine demethylase JARID1a has demethylase-independent function in the circadian clock.

Abstract The Long-read RNA-Seq Genome Annotation Assessment Project Consortium was formed to evaluate the effectiveness of long-read approaches for transcriptome analysis. Using different protocols and sequencing platforms, the consortium generated over 427 million long-read sequences from complementary DNA and direct RNA datasets, encompassing human, mouse and manatee species. Developers utilized these data to address challenges in transcript isoform detection, quantification and de novo transcript detection. The study revealed that libraries with longer, more accurate sequences produce more accurate transcripts than those with increased read depth, whereas greater read depth improved quantification accuracy. In well-annotated genomes, tools based on reference sequences demonstrated the best performance. Incorporating additional orthogonal data and replicate samples is advised when aiming to detect rare and novel transcripts or using reference-free approaches. This collaborative study offers a benchmark for current practices and provides direction for future method development in transcriptome analysis.