The specialized junction between a T lymphocyte and an antigen-presenting cell, the immunological synapse, consists of a central cluster of T cell receptors surrounded by a ring of adhesion molecules. Immunological synapse formation is now shown to be an active and dynamic mechanism that allows T cells to distinguish potential antigenic ligands. Initially, T cell receptor ligands were engaged in an outermost ring of the nascent synapse. Transport of these complexes into the central cluster was dependent on T cell receptor–ligand interaction kinetics. Finally, formation of a stable central cluster at the heart of the synapse was a determinative event for T cell proliferation.

Hepatitis C virus (HCV) is the major cause of transfusion-acquired non-A, non-B hepatitis. HCV is an enveloped positive-sense RNA virus which has been classified as a new genus in the flavivirus family. Like the other two genera in this family, the flaviviruses and the pestiviruses, HCV polypeptides appear to be produced by translation of a long open reading frame and subsequent proteolytic processing of this polyprotein. In this study, a cDNA clone encompassing the long open reading frame of the HCV H strain (3,011 amino acid residues) has been assembled and sequenced. This clone and various truncated derivatives were used in vaccinia virus transient-expression assays to map HCV-encoded polypeptides and to study HCV polyprotein processing. HCV polyproteins and cleavage products were identified by using convalescent human sera and a panel of region-specific polyclonal rabbit antisera. Similar results were obtained for several mammalian cell lines examined, including the human HepG2 hepatoma line. The data indicate that at least nine polypeptides are produced by cleavage of the HCV H strain polyprotein. Putative structural proteins, located in the N-terminal one-fourth of the polyprotein, include the capsid protein C (21 kDa) followed by two possible virion envelope proteins, E1 (31 kDa) and E2 (70 kDa), which are heavily modified by N-linked glycosylation. The remainder of the polyprotein probably encodes nonstructural proteins including NS2 (23 kDa), NS3 (70 kDa), NS4A (8 kDa), NS4B (27 kDa), NS5A (58 kDa), and NS5B (68 kDa). An 82- to 88-kDa glycoprotein which reacted with both E2 and NS2-specific HCV antisera was also identified (called E2-NS2). Preliminary results suggest that a fraction of E1 is associated with E2 and E2-NS2 via disulfide linkages.

Spontaneous resolution of hepatitis C virus (HCV) infection in humans usually affords long-term immunity to persistent viremia and associated liver diseases. Here, we report that memory CD4+ Tcells are essential for this protection. Antibody-mediated depletion of CD4+ Tcells before reinfection of two immune chimpanzees resulted in persistent, low-level viremia despite functional intra-hepatic memory CD8+ Tcell responses. Incomplete control of HCV replication by memory CD8+ Tcells in the absence of adequate CD4+ Tcell help was associated with emergence of viral escape mutations in class I major histocompatibility complex-restricted epitopes and failure to resolve HCV infection.

Few hepatitis C virus (HCV) infections resolve spontaneously but those that do appear to afford protective immunity. Second infections are usually shorter in duration and are less likely to persist but mechanisms of virus control in immune individuals have not been identified. In this study we investigated whether memory helper and/or cytotoxic T lymphocytes provide protection in chimpanzees serially reinfected with the virus. Clearance of the first infection took 3–4 mo and coincided with the delayed onset of CD4+ and CD8+ T cell responses. High frequencies of memory T cells targeting multiple HCV proteins were stable over 7 yr of follow-up. Animals were infected for a second time to assess the protective role of memory T cells. In contrast to the prolonged course of the first infection, viremia was terminated within 14 d. Control of this second infection was kinetically linked to rapid acquisition of virus-specific cytolytic activity by liver resident CD8+ T cells and expansion of memory CD4+ and CD8+ T cells in blood. The importance of memory CD8+ T cells in control of HCV infection was confirmed by antibody-mediated depletion of this lymphocyte subset before a third infection. Virus replication was prolonged despite the presence of memory CD4+ T helper cells primed by the two prior infections and was not terminated until HCV-specific CD8+ T cells recovered in the liver. These experiments demonstrate an essential role for memory CD8+ T cells in long-term protection from chronic hepatitis C.

Processing of the hepatitis C virus (HCV) H strain polyprotein yields at least nine distinct cleavage products: NH2-C-E1-E2-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-CO OH. As described in this report, site-directed mutagenesis and transient expression analyses were used to study the role of a putative serine proteinase domain, located in the N-terminal one-third of the NS3 protein, in proteolytic processing of HCV polyproteins. All four cleavages which occur C terminal to the proteinase domain (3/4A, 4A/4B, 4B/5A, and 5A/5B) were abolished by substitution of alanine for either of two predicted residues (His-1083 and Ser-1165) in the proteinase catalytic triad. However, such substitutions have no observable effect on cleavages in the structural region or at the 2/3 site. Deletion analyses suggest that the structural and NS2 regions of the polyprotein are not required for the HCV NS3 proteinase activity. NS3 proteinase-dependent cleavage sites were localized by N-terminal sequence analysis of NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B. Sequence comparison of the residues flanking these cleavage sites for all sequenced HCV strains reveals conserved residues which may play a role in determining HCV NS3 proteinase substrate specificity. These features include an acidic residue (Asp or Glu) at the P6 position, a Cys or Thr residue at the P1 position, and a Ser or Ala residue at the P1' position.

Background & Aims: Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Current therapy with pegylated interferon α (IFN-α) in combination with ribavirin is associated with adverse effects and often fails to induce a sustained response. IFN-λs, recently discovered IFN gene family members, exhibit antiviral and cell stimulatory activities similar to IFN-α. We aimed to determine whether IFN-λ exhibits antiviral activity toward HCV and to compare the signal transduction and effector gene pathways with those of IFN-α. Methods: Using the HCV replicon system and cell culture infectious reporter virus, we compared IFN-α and IFN-λ effects on HCV RNA replication and protein expression, as measured by quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction, luciferase expression, and Western blot. Receptor expression and signaling pathways were explored using flow cytometry and Western blot. IFN-α- and IFN-λ-mediated gene expression changes were compared using microarray analyses. Results: IFN-λ exhibited dose- and time-dependent HCV inhibition, independent of types I and II IFN receptors. The kinetics of IFN-λ-mediated signal transducers and activators of transcription (STAT) activation and induction of potential effector genes were distinct from those of IFN-α. IFN-λ induced steady increases in levels of known interferon stimulated genes (ISGs), whereas IFN-α ISGs peaked early and declined rapidly. IFN-λ inhibited replication of HCV genotypes 1 and 2 and enhanced the antiviral efficacy of subsaturating levels of IFN-α. Conclusions: These results demonstrate distinct differences in IFN-λ- and IFN-α-induced antiviral states. Understanding these differences may prove useful for developing new HCV treatment strategies. Background & Aims: Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Current therapy with pegylated interferon α (IFN-α) in combination with ribavirin is associated with adverse effects and often fails to induce a sustained response. IFN-λs, recently discovered IFN gene family members, exhibit antiviral and cell stimulatory activities similar to IFN-α. We aimed to determine whether IFN-λ exhibits antiviral activity toward HCV and to compare the signal transduction and effector gene pathways with those of IFN-α. Methods: Using the HCV replicon system and cell culture infectious reporter virus, we compared IFN-α and IFN-λ effects on HCV RNA replication and protein expression, as measured by quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction, luciferase expression, and Western blot. Receptor expression and signaling pathways were explored using flow cytometry and Western blot. IFN-α- and IFN-λ-mediated gene expression changes were compared using microarray analyses. Results: IFN-λ exhibited dose- and time-dependent HCV inhibition, independent of types I and II IFN receptors. The kinetics of IFN-λ-mediated signal transducers and activators of transcription (STAT) activation and induction of potential effector genes were distinct from those of IFN-α. IFN-λ induced steady increases in levels of known interferon stimulated genes (ISGs), whereas IFN-α ISGs peaked early and declined rapidly. IFN-λ inhibited replication of HCV genotypes 1 and 2 and enhanced the antiviral efficacy of subsaturating levels of IFN-α. Conclusions: These results demonstrate distinct differences in IFN-λ- and IFN-α-induced antiviral states. Understanding these differences may prove useful for developing new HCV treatment strategies. Hepatitis C virus (HCV) infection is a growing public health problem affecting 170 million people worldwide (approximately 3 million in the United States). Acute HCV infection is largely asymptomatic with 60%–70% having no apparent symptoms.1Centers for Disease Control and PreventionRecommendations for prevention and control of hepatitis C virus (HCV) infection and HCV-related chronic disease.MMWR Recomm Rep. 1998; 47: 1-39Google Scholar Only a minority of those infected is able to clear HCV after several months.2Alter M.J. Margolis H.S. Krawczynski K. Judson F.N. Mares A. Alexander W.J. Hu P.Y. Miller J.K. Gerber M.A. Sampliner R.E. et al.The Sentinel Counties Chronic non-A, non-B Hepatitis Study TeamThe natural history of community-acquired hepatitis C in the United States.N Engl J Med. 1992; 327: 1899-1905Crossref PubMed Scopus (1633) Google Scholar, 3Alter M.J. Kruszon-Moran D. Nainan O.V. McQuillan G.M. Gao F. Moyer L.A. Kaslow R.A. Margolis H.S. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1988 through 1994.N Engl J Med. 1999; 341: 556-562Crossref PubMed Scopus (2457) Google Scholar Instead, 70%–80% of patients become chronic carriers who, in addition to being the source for most new infections, can progress to chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma.3Alter M.J. Kruszon-Moran D. Nainan O.V. McQuillan G.M. Gao F. Moyer L.A. Kaslow R.A. Margolis H.S. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1988 through 1994.N Engl J Med. 1999; 341: 556-562Crossref PubMed Scopus (2457) Google Scholar These clinical sequelae now comprise the leading indication for liver transplantation in the United States and account for significant morbidity and mortality each year.4Fishman J.A. Rubin R.H. Koziel M.J. Periera B.J. Hepatitis C virus and organ transplantation.Transplantation. 1996; 62: 147-154Crossref PubMed Scopus (109) Google Scholar Despite its potentially grave clinical consequences, the only licensed therapy for chronic HCV infection is pegylated interferon (IFN)-α, either alone or in combination with the nucleoside analog ribavirin. This therapy is expensive, associated with poor response rates, and laden with significant adverse effects.5Reichard O. Schvarcz R. Weiland O. Therapy of hepatitis C: α interferon and ribavirin.Hepatology. 1997; 26: 108S-111SCrossref PubMed Scopus (101) Google Scholar The treatment is capable of inducing sustained virologic responses in only approximately 50% of HCV genotype 1-infected patients.6Foser S. Weyer K. Huber W. Certa U. Improved biological and transcriptional activity of monopegylated interferon-α-2a isomers.Pharmacogenomics J. 2003; 3: 312-319Crossref PubMed Scopus (16) Google Scholar, 7McHutchison J.G. Hepatitis C advances in antiviral therapy: what is accepted treatment now?.J Gastroenterol Hepatol. 2002; 17: 431-441Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar Until recently, the study of HCV was hampered by the lack of a suitable tissue culture system. With advent of the replicon system (see Lindenbach and Rice8Lindenbach B.D. Rice C.M. Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function.Nature. 2005; 436: 933-938Crossref PubMed Scopus (698) Google Scholar for review; Figure 1A), it became possible to study the effects of immunomodulatory cytokines such as IFNs, interleukin (IL)-1β, and tumor necrosis factor (TNF) family members on HCV replication in vitro.9Cheney I.W. Lai V.C. Zhong W. Brodhag T. Dempsey S. Lim C. Hong Z. Lau J.Y. Tam R.C. Comparative analysis of anti-hepatitis C virus activity and gene expression mediated by α, β, and γ interferons.J Virol. 2002; 76: 11148-11154Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar, 10Frese M. Barth K. Kaul A. Lohmann V. Schwarzle V. Bartenschlager R. Hepatitis C virus RNA replication is resistant to tumour necrosis factor-α.J Gen Virol. 2003; 84: 1253-1259Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar, 11Frese M. Pietschmann T. Moradpour D. Haller O. Bartenschlager R. Interferon-α inhibits hepatitis C virus subgenomic RNA replication by an MxA-independent pathway.J Gen Virol. 2001; 82: 723-733Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar, 12Frese M. Schwarzle V. Barth K. Krieger N. Lohmann V. Mihm S. Haller O. Bartenschlager R. Interferon-γ inhibits replication of subgenomic and genomic hepatitis C virus RNAs.Hepatology. 2002; 35: 694-703Crossref PubMed Scopus (277) Google Scholar, 13Guo J.T. Bichko V.V. Seeger C. Effect of α interferon on the hepatitis C virus replicon.J Virol. 2001; 75: 8516-8523Crossref PubMed Scopus (422) Google Scholar, 14Lanford R.E. Guerra B. Lee H. Averett D.R. Pfeiffer B. Chavez D. Notvall L. Bigger C. Antiviral effect and virus-host interactions in response to α interferon, γ interferon, poly(i)-poly(c), tumor necrosis factor α, and ribavirin in hepatitis C virus subgenomic replicons.J Virol. 2003; 77: 1092-1104Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 15Wang C. Pflugheber J. Sumpter Jr, R. Sodora D.L. Hui D. Sen G.C. Gale Jr., M. Alpha interferon induces distinct translational control programs to suppress hepatitis C virus RNA replication.J Virol. 2003; 77: 3898-3912Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 16Zhu H. Liu C. Interleukin-1 inhibits hepatitis C virus subgenomic RNA replication by activation of extracellular regulated kinase pathway.J Virol. 2003; 77: 5493-5498Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar The further development of a cell culture system allowing the complete replication of HCV17Lindenbach B.D. Evans M.J. Syder A.J. Wölk B. Tellinghuisen T.L. Liu C.C. Maruyama T. Hynes R.O. Burton D.R. McKeating J.A. Rice C.M. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.Science. 2005; 309: 623-626Crossref PubMed Scopus (1973) Google Scholar opens up the possibility to study IFN effects on the complete HCV life cycle. IFNs exhibit a broad range of antiviral mechanisms in vivo, both, directly, by inducing an antiviral state through expression of various intracellular genes18Samuel C.E. Antiviral actions of interferons.Clin Microbiol Rev. 2001; 14: 778-809Crossref PubMed Scopus (2191) Google Scholar, 19Katze M.G. He Y. Gale Jr., M. Viruses and interferon: a fight for supremacy.Nat Rev Immunol. 2002; 2: 675-687Crossref PubMed Scopus (936) Google Scholar and, indirectly, by stimulating immune effector functions including activation of natural killer and macrophage cells and up-regulation of major histocompatibility complex expression on and activation of professional antigen-presenting cells.20Brierley M.M. Fish E.N. Review: IFN-α/β receptor interactions to biologic outcomes: understanding the circuitry.J Interferon Cytokine Res. 2002; 22: 835-845Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar, 21Goodbourn S. Didcock L. Randall R.E. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures.J Gen Virol. 2000; 81: 2341-2364Crossref PubMed Scopus (861) Google Scholar In the HCV replicon system, addition of IFN-α and IFN-γ has been shown to inhibit HCV RNA replication in a dose-dependent manner.9Cheney I.W. Lai V.C. Zhong W. Brodhag T. Dempsey S. Lim C. Hong Z. Lau J.Y. Tam R.C. Comparative analysis of anti-hepatitis C virus activity and gene expression mediated by α, β, and γ interferons.J Virol. 2002; 76: 11148-11154Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar, 11Frese M. Pietschmann T. Moradpour D. Haller O. Bartenschlager R. Interferon-α inhibits hepatitis C virus subgenomic RNA replication by an MxA-independent pathway.J Gen Virol. 2001; 82: 723-733Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar, 12Frese M. Schwarzle V. Barth K. Krieger N. Lohmann V. Mihm S. Haller O. Bartenschlager R. Interferon-γ inhibits replication of subgenomic and genomic hepatitis C virus RNAs.Hepatology. 2002; 35: 694-703Crossref PubMed Scopus (277) Google Scholar Recent findings indicate that, when used in combination, IFN-α and IFN-γ act synergistically to down-regulate HCV RNA levels in replicon-containing cells.22Larkin J. Jin L. Farmen M. Venable D. Huang Y. Tan S.L. Glass J.I. Synergistic antiviral activity of human interferon combinations in the hepatitis C virus replicon system.J Interferon Cytokine Res. 2003; 23: 247-257Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar Although less efficient than IFN-α and IFN-γ, the addition of IL-1β to HCV replicon-harboring Huh-7 cells has also been shown to reduce the level of HCV RNA.16Zhu H. Liu C. Interleukin-1 inhibits hepatitis C virus subgenomic RNA replication by activation of extracellular regulated kinase pathway.J Virol. 2003; 77: 5493-5498Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar Interestingly, although TNF-α shares overlapping sets of antiviral defense mechanisms with the cytokines mentioned above and contributes to the clearance of other viral infections,23Seo S.H. Webster R.G. Tumor necrosis factor α exerts powerful anti-influenza virus effects in lung epithelial cells.J Virol. 2002; 76: 1071-1076Crossref PubMed Google Scholar, 24Kawanishi Y. Hayashi N. Katayama K. Ueda K. Takehara T. Miyoshi E. Mita E. Kasahara A. Fusamoto H. Kamada T. Tumor necrosis factor-α and interferon-γ inhibit synergistically viral replication in hepatitis B virus-replicating cells.J Med Virol. 1995; 47: 272-277Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar, 25Benedict C.A. Viruses and the TNF-related cytokines, an evolving battle.Cytokine Growth Factor Rev. 2003; 14: 349-357Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (61) Google Scholar it does not have any effect on HCV replication in Huh-7 hepatoma cells.10Frese M. Barth K. Kaul A. Lohmann V. Schwarzle V. Bartenschlager R. Hepatitis C virus RNA replication is resistant to tumour necrosis factor-α.J Gen Virol. 2003; 84: 1253-1259Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar, 14Lanford R.E. Guerra B. Lee H. Averett D.R. Pfeiffer B. Chavez D. Notvall L. Bigger C. Antiviral effect and virus-host interactions in response to α interferon, γ interferon, poly(i)-poly(c), tumor necrosis factor α, and ribavirin in hepatitis C virus subgenomic replicons.J Virol. 2003; 77: 1092-1104Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar Type I IFNs are a homologous family of cytokines clustered on chromosome 9 that include 13 IFN-α isotypes, IFN-β, IFN-ω, IFN-κ, and IFN-ε.26Langer J.A. Cutrone E.C. Kotenko S. The class II cytokine receptor (CRF2) family: overview and patterns of receptor-ligand interactions.Cytokine Growth Factor Rev. 2004; 15: 33-48Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (169) Google Scholar, 27Kotenko S.V. Langer J.A. Full house: 12 receptors for 27 cytokines.Int Immunopharmacol. 2004; 4: 593-608Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar All of these transduce their signals through the same IFN-α/β receptor that is formed by 2 subchains: IFN-αR1 and IFN-αR2. IFN-γ, located on chromosome 12, is the only member of the type II IFN group and binds to the IFN-γ receptor that is composed of the IFN-γR1 and IFN-γR2 subchains. A newly discovered family of cytokines, termed either IL-28A, IL-28B, and IL-2928Sheppard P. Kindsvogel W. Xu W. Henderson K. Schlutsmeyer S. Whitmore T.E. Kuestner R. Garrigues U. Birks C. Roraback J. Ostrander C. Dong D. Shin J. Presnell S. Fox B. Haldeman B. Cooper E. Taft D. Gilbert T. Grant F.J. Tackett M. Krivan W. McKnight G. Clegg C. Foster D. Klucher K.M. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R.Nat Immunol. 2003; 4: 63-68Crossref PubMed Scopus (1343) Google Scholar or IFN-λ1, -λ2, and -λ3,29Kotenko S.V. Gallagher G. Baurin V.V. Lewis-Antes A. Shen M. Shah N.K. Langer J.A. Sheikh F. Dickensheets H. Donnelly R.P. IFN-λs mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.Nat Immunol. 2003; 4: 69-77Crossref PubMed Scopus (1576) Google Scholar utilize a heterodimeric receptor consisting of the newly identified IFN-λR1 and a second subunit, IL-10R2 (Figure 1B). These cytokines are functionally similar to type I IFNs; they have been shown to render cells resistant to encephalomyocarditis virus (EMCV) or vesicular stomatitis virus (VSV) infections, and their expression is induced by viral infections in various cell lines suggesting similar regulatory and functional effector elements to type I IFNs. Recent studies show some specificity to their antiviral effects and differences in efficacy in vitro vs in vivo. Although IFN-λ was not noted to have antiviral activity against HSV-2 in vitro, it demonstrated substantial antiviral effects in vivo, highlighting the possibility that the majority of IFN-λ's antiviral effects may involve immune modulation.30Ank N. West H. Bartholdy C. Eriksson K. Thomsen A.R. Paludan S.R. Lambda interferon (IFN-λ), a type III IFN, is induced by viruses and IFNs and displays potent antiviral activity against select virus infections in vivo.J Virol. 2006; 80: 4501-4509Crossref PubMed Scopus (504) Google Scholar Similar to type I IFN signaling, IFN-λ receptor engagement leads to the formation of the IFN-stimulated gene factor (ISGF) 3 and subsequent transcription of IFN-stimulated response element (ISRE) controlled genes encoding 2′5′OAS or MxA protein.29Kotenko S.V. Gallagher G. Baurin V.V. Lewis-Antes A. Shen M. Shah N.K. Langer J.A. Sheikh F. Dickensheets H. Donnelly R.P. IFN-λs mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.Nat Immunol. 2003; 4: 69-77Crossref PubMed Scopus (1576) Google Scholar Despite the functional similarities with type I IFNs, clear evidence exists that IFN-λs represent a distinct family.31Donnelly R.P. Sheikh F. Kotenko S.V. Dickensheets H. The expanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2 (IL-10R2) chain.J Leukoc Biol. 2004; 76: 314-321Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar In a recent paper, Robek et al showed that, in an immortalized murine hepatocyte cell line (HBV-Met), IFN-λ inhibits hepatitis B virus replication and leads to the induction of interferon-stimulated gene (ISG)15 and interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats (IFIT)3.32Robek M.D. Boyd B.S. Chisari F.V. Lambda interferon inhibits hepatitis B and C virus replication.J Virol. 2005; 79: 3851-3854Crossref PubMed Scopus (395) Google Scholar The induction of the observed genes appeared to be prolonged relative to those induced by IFN-β, which peaked at 6 hours and declined thereafter. In addition, treatment of Huh-7 cells harboring the subgenomic or full-length HCV replicons with 100 ng/mL of IFN-λ resulted in induced MxA expression and a >90% reduction in HCV RNA levels.32Robek M.D. Boyd B.S. Chisari F.V. Lambda interferon inhibits hepatitis B and C virus replication.J Virol. 2005; 79: 3851-3854Crossref PubMed Scopus (395) Google Scholar However, the role of the IFN-α and IFN-γ receptor molecules in IFN-λ-mediated effects on HCV replication and the involved signal transduction pathways that lead to IFN-λ-specific gene expression were not studied. Binding of the IFNs to their cognate receptor subunits leads to dimerization of the receptor chains and activation of the receptor associated Janus kinases (Figure 1B). Phosphorylation of Janus kinases leads to further downstream phosphorylation of the latent cytoplasmic proteins signal transducers and activators of transcription (STATs). Their rapid activation can be detected minutes after receptor engagement. For the IFN-α and IFN-λ signaling cascades, activated STAT1 and STAT2 heterodimerize and together with IRF9 form the trimeric ISGF3 complex competent for nuclear translocation. In the nucleus, ISGF3 binds to the cis-acting DNA element, designated ISRE, upstream of IFN-inducible genes, and modulates their transcription.28Sheppard P. Kindsvogel W. Xu W. Henderson K. Schlutsmeyer S. Whitmore T.E. Kuestner R. Garrigues U. Birks C. Roraback J. Ostrander C. Dong D. Shin J. Presnell S. Fox B. Haldeman B. Cooper E. Taft D. Gilbert T. Grant F.J. Tackett M. Krivan W. McKnight G. Clegg C. Foster D. Klucher K.M. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R.Nat Immunol. 2003; 4: 63-68Crossref PubMed Scopus (1343) Google Scholar, 29Kotenko S.V. Gallagher G. Baurin V.V. Lewis-Antes A. Shen M. Shah N.K. Langer J.A. Sheikh F. Dickensheets H. Donnelly R.P. IFN-λs mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.Nat Immunol. 2003; 4: 69-77Crossref PubMed Scopus (1576) Google Scholar, 33Lau J.F. Horvath C.M. Mechanisms of type I interferon cell signaling and STAT-mediated transcriptional responses Mt.Sinai J Med. 2002; 69: 156-168PubMed Google Scholar Up-regulation of ISGs can be detected only a few hours after receptor activation. In response to IFN treatment, the antiviral effect on HCV RNA replication mediated by a subset of these genes is detectable within 12 hours and leads to a readily identifiable decrease in viral protein levels after 24 hours. IFN-γ signaling relies mainly on the formation of STAT1 homodimers, which bind to the cis-acting GAS element in the upstream promoter region of IFN-γ inducible genes.34Ramana C.V. Gil M.P. Schreiber R.D. Stark G.R. Stat1-dependent and -independent pathways in IFN-γ-dependent signaling.Trends Immunol. 2002; 23: 96-101Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (474) Google Scholar Microarray expression studies indicate that the human genome encodes several hundred functionally diverse IFN-stimulated genes (ISGs).35de Veer M.J. Holko M. Frevel M. Walker E. Der S. Paranjape J.M. Silverman R.H. Williams B.R. Functional classification of interferon-stimulated genes identified using microarrays.J Leukoc Biol. 2001; 69: 912-920PubMed Google Scholar, 36Der S.D. Zhou A. Williams B.R. Silverman R.H. Identification of genes differentially regulated by interferon α, β, or γ using oligonucleotide arrays.Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 15623-15628Crossref PubMed Scopus (1558) Google Scholar The complete spectrum of ISGs that mediate an antiviral effect on HCV replication has not yet been identified.37Gale Jr., M. Effector genes of interferon action against hepatitis C virus.Hepatology. 2003; 37: 975-978Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar Treatment of Huh-7 cells containing HCV replicons with type I and type II IFNs has been shown to induce distinct messenger RNA (mRNA) patterns.9Cheney I.W. Lai V.C. Zhong W. Brodhag T. Dempsey S. Lim C. Hong Z. Lau J.Y. Tam R.C. Comparative analysis of anti-hepatitis C virus activity and gene expression mediated by α, β, and γ interferons.J Virol. 2002; 76: 11148-11154Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar Interestingly, even though IFN-α and IFN-β (both type I IFNs) share the same receptor, in human astrocytoma or human fibrosarcoma cells they induce mRNA expression patterns that clearly diverge.36Der S.D. Zhou A. Williams B.R. Silverman R.H. Identification of genes differentially regulated by interferon α, β, or γ using oligonucleotide arrays.Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 15623-15628Crossref PubMed Scopus (1558) Google Scholar, 38Rani M.R. Foster G.R. Leung S. Leaman D. Stark G.R. Ransohoff R.M. Characterization of β-R1, a gene that is selectively induced by interferon β (IFN-β) compared with IFN-α.J Biol Chem. 1996; 271: 22878-22884Crossref PubMed Scopus (156) Google Scholar In this report, we examine the antiviral effects of IFN-λ1 (IFN-λ) on HCV replicon and cell culture virus replication in Huh-7.5 hepatoma cells. This system serves as an excellent model to study components of the signaling pathway, the induced genes, and the antiviral effect in response to IFN treatment. By comparing and contrasting IFN-α2 (IFN-α) and IFN-λ, we demonstrate that, although they both share similar intracellular-signaling pathways, clear differences exist in the activation and induction of potential effector genes that ultimately result in different antiviral potencies. Huh-7.5 monolayers were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco, Carlsbad, CA) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) (Gibco) and 0.1 mmol/L MEM nonessential amino acid solution (Gibco) at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2. For cells supporting full-length HCV replicons, G418 (Gibco) at 750 μg/mL was added to the culture medium. The full-length HCV Con1 (genotype 1b) bicistronic replicon shown in Figure 1A was used for all replicon studies. In this replicon, the HCV internal ribosome entry site (IRES) drives expression of neomycin phosphotransferase (neo); the EMCV IRES mediates translation of the HCV structural and nonstructural proteins, core through NS5B. This replicon contains the highly adaptive serine to isoleucine substitution in NS5A at polyprotein amino acid 2204.39Blight K.J. McKeating J.A. Marcotrigiano J. Rice C.M. Efficient replication of hepatitis C virus genotype 1a RNAs in cell culture.J Virol. 2003; 77: 3181-3190Crossref PubMed Scopus (294) Google Scholar Stable cell populations were derived by transfection of the highly permissive Huh-7.5 subline39Blight K.J. McKeating J.A. Marcotrigiano J. Rice C.M. Efficient replication of hepatitis C virus genotype 1a RNAs in cell culture.J Virol. 2003; 77: 3181-3190Crossref PubMed Scopus (294) Google Scholar with transcribed RNA followed by G418 selection. This selected cell population is referred to as FL-neo cells throughout this study. Cells were cultured in regular media without the addition of G418 for at least 24 hours before each experiment. FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi HCV cell culture virus (HCVcc), a monocistronic HCV genotype 2a virus expressing Renilla luciferase as a ubiquitin- and self-cleavable amino terminal extension of the J6/JFH1 HCV17Lindenbach B.D. Evans M.J. Syder A.J. Wölk B. Tellinghuisen T.L. Liu C.C. Maruyama T. Hynes R.O. Burton D.R. McKeating J.A. Rice C.M. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.Science. 2005; 309: 623-626Crossref PubMed Scopus (1973) Google Scholar polyprotein has been previously described and characterized.40Tscherne D.M. Jones C.T. Evans M.J. Lindenbach B.D. McKeating J.A. Rice C.M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry.J Virol. 2006; 80: 1734-1741Crossref PubMed Scopus (327) Google Scholar This virus, designated J6/JFH1 HCVcc, is shown schematically in Figure 1A. HCVcc stocks were generated by collection of the culture medium from Huh-7.5 cells electroporated with in vitro transcribed RNA as described.40Tscherne D.M. Jones C.T. Evans M.J. Lindenbach B.D. McKeating J.A. Rice C.M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry.J Virol. 2006; 80: 1734-1741Crossref PubMed Scopus (327) Google Scholar Stock titers (tissue culture infectious dose [TCID]50) were determined as described.17Lindenbach B.D. Evans M.J. Syder A.J. Wölk B. Tellinghuisen T.L. Liu C.C. Maruyama T. Hynes R.O. Burton D.R. McKeating J.A. Rice C.M. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.Science. 2005; 309: 623-626Crossref PubMed Scopus (1973) Google Scholar Infection of Huh-7.5 cells, seeded in 24-well plates the day before, was performed with 200 μL undiluted HCVcc stock (2.15 × 102 TCID50/mL) and allowed to proceed for 2 hours at 37°C, after which unbound virus was washed away with phosphate-buffered saline (PBS), and the medium was replaced. After an additional 48 hours, cells were washed with PBS and assayed for luciferase activity using the Renilla luciferase assay system (Promega, Madison, WI) according to the manufacturer's instructions and as previously described.40Tscherne D.M. Jones C.T. Evans M.J. Lindenbach B.D. McKeating J.A. Rice C.M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry.J Virol. 2006; 80: 1734-1741Crossref PubMed Scopus (327) Google Scholar For IFN treatment, cytokine was added to the cells 12 hours prior to infection. After the 2-hour infection, performed in the absence of cytokine, medium containing freshly diluted cytokine was added for the duration of the 48-hour infection period. Human leukocyte IFN-α2 (IFN-α) and human recombinant IFN-γ were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Escherichia coli-produced human IFN-λ1 (IFN-λ) was obtained from Peprotech (Rocky Hill, NJ). Primary antibodies used for immunoblotting were mouse anti-HCV NS5A (Virostat, Portland, ME) (1:100), mouse anti-human β-actin (Sigma Chemical Co.) (1:5000), rabbit anti-human phospho-STAT1 (Tyr701) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) (1:500), rabbit anti-human phospho-STAT2 (Tyr689) (Upstate, Lake Placid, NY) (1:1000), mouse anti-STAT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) (1:100), and mouse anti-human STAT2 (Santa Cruz Biotechnology) (1:100). Secondary antibodies used for immunoblotting were rabbit anti-mouse IgG HRP (Pierce, Rockford, IL) and goat anti-rabbit IgG HRP (Pierce) (1:10,000). Primary antibodies used for flow cytometric analysis (FACS) were mouse anti-human IFN-αR2 (USBiological, Swampscott, MA), mouse anti-human IFN-γR1 (R&D Systems, Minneapolis, MN), and goat anti-human IL-10R2 (R&D Systems) at 0.5, 0.5, and 1 μg per 2 × 105 cells, respectively. Secondary antibodies used for FACS analysis were Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) and PE-labeled donkey anti-goat IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, PA) at 0.3 μg for 2 × 105 cells. Normal mouse serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories) and normal goat serum (Sigma Chemical Co.) were used as negative controls. Receptor blocking antibodies used for inhibiting cytokine-mediated effector functions were mouse anti-human IFN-αR2 (USBiological), mouse anti-human IFN-γR1 (R&D Systems), and goat anti-human IL-10 R2 (R&D Systems) at 20, 2, and 40 μg/mL, respectively. Total cellular RNA was extracted and isolated using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) according to the manufacturer's instructions. An 80-ng aliquot of total RNA was used to quantify HCV-specific RNA levels using an ABI Prism 7700 sequence detector (Applied Biosystems, Foster City, CA). Real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) amplifications were performed using the Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step system (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) and primers specific for the HCV 5′ NTR: 5′-CCTCTAGAGCCATAGTGGTCT-3′ (sense, 10 μmol/L); 5′-CCAAATCTCCAGGCATTGAGC-3′(antisense, 10 μmol/L); and 6-carboxyfluorescein-CACCGGAATTGCCAGGACGACCGG (probe, 10 μmol/L; Applied Biosystems). RT reactions were

ABSTRACT The majority of people infected with hepatitis C virus (HCV) fail to generate or maintain a T-cell response effective for viral clearance. Evidence from murine chronic viral infections shows that expression of the coinhibitory molecule PD-1 predicts CD8 + antiviral T-cell exhaustion and may contribute to inadequate pathogen control. To investigate whether human CD8 + T cells express PD-1 and demonstrate a dysfunctional phenotype during chronic HCV infection, peripheral and intrahepatic HCV-specific CD8 + T cells were examined. We found that in chronic HCV infection, peripheral HCV-specific T cells express high levels of PD-1 and that blockade of the PD-1/PD-L1 interaction led to an enhanced proliferative capacity. Importantly, intrahepatic HCV-specific T cells, in contrast to those in the periphery, express not only high levels of PD-1 but also decreased interleukin-7 receptor alpha (CD127), an exhausted phenotype that was HCV antigen specific and compartmentalized to the liver, the site of viral replication.

Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) is a naturally occurring peptide secreted by the L cells of the small intestine. GLP-1 functions as an incretin and stimulates glucose-mediated insulin production by pancreatic β cells. In this study, we demonstrate that exendin-4/GLP-1 has a cognate receptor on human hepatocytes and that exendin-4 has a direct effect on the reduction of hepatic steatosis in the absence of insulin. Both glucagon-like peptide 1 receptor (GLP/R) messenger RNA and protein were detected on primary human hepatocytes, and receptor was internalized in the presence of GLP-1. Exendin-4 increased the phosphorylation of 3-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK-1), AKT, and protein kinase C ζ (PKC-ζ) in HepG2 and Huh7 cells. Small interfering RNA against GLP-1R abolished the effects on PDK-1 and PKC-ζ. Treatment with exendin-4 quantitatively reduced triglyceride stores compared with control-treated cells. Conclusion: This is the first report that the G protein–coupled receptor GLP-1R is present on human hepatocytes. Furthermore, it appears that exendin-4 has the same beneficial effects in vitro as those seen in our previously published in vivo study in ob/ob mice, directly reducing hepatocyte steatosis. Future use for human nonalcoholic fatty liver disease, either in combination with dietary manipulation or other pharmacotherapy, may be a significant advance in treatment of this common form of liver disease. (HEPATOLOGY 2010)

Host and viral proteinases are believed to be required for the production of at least nine hepatitis C virus (HCV)-specific polyprotein cleavage products. Although several cleavages appear to be catalyzed by host signal peptidase or the HCV NS3 serine proteinase, the enzyme responsible for cleavage at the 2/3 site has not been identified. In this report, we have defined the 2/3 cleavage site and obtained evidence which suggests that this cleavage is mediated by a second HCV-encoded proteinase, located between aa 827 and 1207. This region encompasses the C-terminal portion of the 23-kDa NS2 protein, the 2/3 cleavage site, and the serine proteinase domain of NS3. Efficient processing at the 2/3 site was observed in mammalian cells, Escherichia coli, and in plant or animal cell-free translation systems in the absence of microsomal membranes. Cleavage at the 2/3 site was abolished by alanine substitutions for NS2 residues His-952 or Cys-993 but was unaffected by several other substitution mutations, including those that inactivate NS3 serine proteinase function. Mutations abolishing cleavage at the 2/3 site did not block cleavage at other sites in the HCV polyprotein. Cotransfection experiments indicate that the 2/3 site can be cleaved in trans, which should facilitate purification and further characterization of this enzyme.

Sequence homology and molecular modeling studies have suggested that the N-terminal one-third of the flavirvirus nonstructural protein NS3 functions as a trypsin-like serine protease. To examine the putative proteolytic activity of NS3, segments of the yellow fever virus genome were subcloned into plasmid transcription/translation vectors and cell-free translation products were characterized. The results suggest that a protease activity encoded within NS2B and the N-terminal one-third of yellow fever virus NS3 is capable of cis-acting site-specific proteolysis at the NS2B-NS3 cleavage site and dilution-insensitive cleavage of the NS2A-NS2B site. Site-directed mutagenesis of the His-53, Asp-77, and Ser-138 residues of NS3 that compose the proposed catalytic triad implicates this domain as a serine protease. Infectious virus was not recovered from mammalian cells transfected with RNAs transcribed from full-length yellow fever virus cDNA templates containing mutations at Ser-138 (which abolish or dramatically reduce protease activity in vitro), suggesting that the protease is required for viral replication.