Reconstituting Synaptic Vesicle Fusion Membrane fusion reactions have been reconstituted in vitro, but often the reconstituted reactions have not directly mirrored the requirements for synaptic vesicle fusion in vivo. Previous work generally used only N -ethylmaleimide–sensitive factor (NSF) attachment protein SNAP receptors (SNAREs) and one or two additional components and could not explain why deletion of Munc18-1 or Munc13 abolishes neurotransmitter release completely, yielding the severe disruptions of synaptic vesicle release in knockout mouse. Ma et al. (p. 421 , published online 20 December; see the Perspective by Hughson ) now present a faithful reconstitution of synaptic vesicle fusion. Membrane fusion required Munc18-1 and Munc13 when the reconstitution experiments included all eight key components (three SNAREs, Munc18-1, Munc13, synaptotagmin-1, NSF, and α-SNAP).

Hallucinogens like lysergic acid diethylamide (LSD), psilocybin, and substituted N-benzyl phenylalkylamines are widely used recreationally with psilocybin being considered as a therapeutic for many neuropsychiatric disorders including depression, anxiety, and substance abuse. How psychedelics mediate their actions-both therapeutic and hallucinogenic-are not understood, although activation of the 5-HT2A serotonin receptor (HTR2A) is key. To gain molecular insights into psychedelic actions, we determined the active-state structure of HTR2A bound to 25-CN-NBOH-a prototypical hallucinogen-in complex with an engineered Gαq heterotrimer by cryoelectron microscopy (cryo-EM). We also obtained the X-ray crystal structures of HTR2A complexed with the arrestin-biased ligand LSD or the inverse agonist methiothepin. Comparisons of these structures reveal determinants responsible for HTR2A-Gαq protein interactions as well as the conformational rearrangements involved in active-state transitions. Given the potential therapeutic actions of hallucinogens, these findings could accelerate the discovery of more selective drugs for the treatment of a variety of neuropsychiatric disorders.

Abstract Drugs targeting the G protein-coupled μ-opioid receptor (μOR) are the most effective analgesics available but are also associated with fatal respiratory depression. While some partial opioid agonists appear to be safer than full agonists, the signaling pathways responsible for respiratory depression have yet to be elucidated. Here we investigated the structural and mechanistic basis of action of lofentanil (LFT) and mitragynine pseudoindoxyl (MP), two μOR agonists with different safety profiles. LFT, one of the most potent and lethal opioids, and MP, a derivative from the kratom plant with reduced respiratory depression in animal studies at equianalgesic doses, exhibited markedly different signaling efficacy profiles for G protein subtype activation and recruitment of β-arrestins. Cryo-EM structures of the μOR-Gi1 complex with MP (2.5Å) and LFT (3.2Å) revealed that the two ligands engage distinct sub-pockets, and molecular dynamics (MD) simulations showed additional differences in the binding site that propagate to the intracellular side of the receptor where G proteins and β-arrestins bind. While MP favors the precise G protein-bound active state observed in the cryo-EM structures, LFT favors a distinct active state. These results highlight how drugs engaging different parts of the μOR orthosteric pocket can lead to distinct signaling outcomes.

GABA (γ-aminobutyric acid) stimulation of the metabotropic GABAB receptor results in prolonged inhibition of neurotransmission that is central to brain physiology. GABAB belongs to the Family C of G protein-coupled receptors (GPCRs), which operate as dimers to relay synaptic neurotransmitter signals into a cellular response through the binding and activation of heterotrimeric G proteins. GABAB, however, is unique in its function as an obligate heterodimer in which agonist binding and G protein activation take place on distinct subunits. Here we show structures of heterodimeric and homodimeric full-length GABAB receptors. Complemented by cellular signaling assays and atomistic simulations, the structures reveal an essential role for the GABAB extracellular loop 2 (ECL2) in relaying structural transitions by ordering the linker connecting the extracellular ligand-binding domain to the transmembrane region. Furthermore, the ECL2 of both GABAB subunits caps and interacts with the hydrophilic head of a phospholipid occupying the extracellular half of the transmembrane domain, thereby providing a potentially crucial link between ligand binding and the receptor core that engages G protein. These results provide a starting framework to decipher mechanistic modes of signal transduction mediated by GABAB dimers and have important implications for rational drug design targeting these receptors.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Heterotrimeric G proteins communicate signals from activated G protein-coupled receptors to downstream effector proteins. In the phototransduction pathway responsible for vertebrate vision, the G protein-effector complex is comprised of the GTP-bound transducin α subunit (GαT·GTP) and the cyclic GMP (cGMP) phosphodiesterase 6 (PDE6), which stimulates cGMP hydrolysis to transmit signals to the optic nerve. Here we report a cryo-electron microscopy (cryoEM) structure of PDE6 complexed to GTP-bound GαT. The structure reveals two GαT·GTP subunits engaging the PDE6 hetero-tetramer at both the PDE6 catalytic core and the PDEγ subunits, driving extensive rearrangements to relieve all inhibitory constraints on enzyme catalysis. Analysis of the conformational ensemble in the cryoEM data highlights the dynamic nature of the contacts between the two GαT·GTP subunits and PDE6 that support an alternating-site catalytic mechanism.

Summary G protein-coupled receptors (GPCRs) activate heterotrimeric G proteins by stimulating the exchange of guanine nucleotide in the Gα subunit. To visualize this mechanism, we developed a time-resolved cryo-EM approach that examines the progression of ensembles of pre-steady-state intermediates of a GPCR-G protein complex. Using variability analysis to monitor the transitions of the stimulatory Gs protein in complex with the β 2 -adrenergic receptor (β 2 AR) at short sequential time points after GTP addition, we identified the conformational trajectory underlying G protein activation and functional dissociation from the receptor. Twenty transition structures generated from sequential overlapping particle subsets along this trajectory, compared to control structures, provide a high-resolution description of the order of events driving G protein activation upon GTP binding. Structural changes propagate from the nucleotide-binding pocket and extend through the GTPase domain, enacting alterations to Gα Switch regions and the α5 helix that weaken the G protein-receptor interface. Molecular dynamics (MD) simulations with late structures in the cryo-EM trajectory support that enhanced ordering of GTP upon closure of the alpha-helical domain (AHD) against the nucleotide-bound Ras-homology domain (RHD) correlates with irreversible α5 helix destabilization and eventual dissociation of the G protein from the GPCR. These findings also highlight the potential of time-resolved cryo-EM as a tool for mechanistic dissection of GPCR signaling events.