Plant resistance proteins (R proteins) recognize corresponding pathogen avirulence (Avr) proteins either indirectly through detection of changes in their host protein targets or through direct R–Avr protein interaction. Although indirect recognition imposes selection against Avr effector function, pathogen effector molecules recognized through direct interaction may overcome resistance through sequence diversification rather than loss of function. Here we show that the flax rust fungus AvrL567 genes, whose products are recognized by the L5, L6, and L7 R proteins of flax, are highly diverse, with 12 sequence variants identified from six rust strains. Seven AvrL567 variants derived from Avr alleles induce necrotic responses when expressed in flax plants containing corresponding resistance genes ( R genes), whereas five variants from avr alleles do not. Differences in recognition specificity between AvrL567 variants and evidence for diversifying selection acting on these genes suggest they have been involved in a gene-specific arms race with the corresponding flax R genes. Yeast two-hybrid assays indicate that recognition is based on direct R–Avr protein interaction and recapitulate the interaction specificity observed in planta . Biochemical analysis of Escherichia coli -produced AvrL567 proteins shows that variants that escape recognition nevertheless maintain a conserved structure and stability, suggesting that the amino acid sequence differences directly affect the R–Avr protein interaction. We suggest that direct recognition associated with high genetic diversity at corresponding R and Avr gene loci represents an alternative outcome of plant–pathogen coevolution to indirect recognition associated with simple balanced polymorphisms for functional and nonfunctional R and Avr genes.

Rust fungi are some of the most devastating pathogens of crop plants. They are obligate biotrophs, which extract nutrients only from living plant tissues and cannot grow apart from their hosts. Their lifestyle has slowed the dissection of molecular mechanisms underlying host invasion and avoidance or suppression of plant innate immunity. We sequenced the 101-Mb genome of Melampsora larici - populina , the causal agent of poplar leaf rust, and the 89-Mb genome of Puccinia graminis f. sp. tritici , the causal agent of wheat and barley stem rust. We then compared the 16,399 predicted proteins of M. larici-populina with the 17,773 predicted proteins of P. graminis f. sp tritici . Genomic features related to their obligate biotrophic lifestyle include expanded lineage-specific gene families, a large repertoire of effector-like small secreted proteins, impaired nitrogen and sulfur assimilation pathways, and expanded families of amino acid and oligopeptide membrane transporters. The dramatic up-regulation of transcripts coding for small secreted proteins, secreted hydrolytic enzymes, and transporters in planta suggests that they play a role in host infection and nutrient acquisition. Some of these genomic hallmarks are mirrored in the genomes of other microbial eukaryotes that have independently evolved to infect plants, indicating convergent adaptation to a biotrophic existence inside plant cells.

Thirteen alleles (L, L1 to L11, and LH) from the flax L locus, which encode Toll/interleukin-1 receptor homology-nucleotide binding site-leucine-rich repeat (TIR-NBS-LRR) rust resistance proteins, were sequenced and compared to provide insight into their evolution and into the determinants of gene-for-gene resistance specificity. The predicted L6 and L11 proteins differ solely in the LRR region, whereas L6 and L7 differ solely in the TIR region. Thus, specificity differences between alleles can be determined by both the LRR and TIR regions. Functional analysis in transgenic plants of recombinant alleles constructed in vitro provided further information: L10-L2 and L6-L2 recombinants, encoding the LRR of L2, conferred L2 resistance specificity, and an L2-L10 recombinant, encoding the LRR of L10, conferred a novel specificity. The sequence comparisons also indicate that the evolution of L alleles has probably involved reassortment of variation, resulting from accumulated point mutations, by intragenic recombination. In addition, large deletion events have occurred in the LRR-encoding regions of L1 and L8, and duplication events have occurred in the LRR-encoding region of L2.

Abstract Rust fungi, obligate biotrophs that cause disease and yield losses in crops such as cereals and soybean (Glycine max), obtain nutrients from the host through haustoria, which are specialized structures that develop within host cells. Resistance of flax (Linum usitatissimum) to flax rust (Melampsora lini) involves the induction of a hypersensitive cell death response at haustoria formation sites, governed by gene-for-gene recognition between host resistance and pathogen avirulence genes. We identified genes encoding haustorially expressed secreted proteins (HESPs) by screening a flax rust haustorium-specific cDNA library. Among 429 unigenes, 21 HESPs were identified, one corresponding to the AvrL567 gene. Three other HESPs cosegregated with the independent AvrM, AvrP4, and AvrP123 loci. Expression of these genes in flax induced resistance gene–mediated cell death with the appropriate specificity, confirming their avirulence activity. AvrP4 and AvrP123 are Cys-rich proteins, and AvrP123 contains a Kazal Ser protease inhibitor signature, whereas AvrM contains no Cys residues. AvrP4 and AvrM induce cell death when expressed intracellularly, suggesting their translocation into plant cells during infection. However, secreted AvrM and AvrP4 also induce necrotic responses, with secreted AvrP4 more active than intracellular AvrP4, possibly as a result of enhanced formation of endoplasmic reticulum–dependent disulfide bonds. Addition of an endoplasmic reticulum retention signal inhibited AvrM-induced necrosis, suggesting that both AvrM and AvrP4 can reenter the plant cell after secretion in the absence of the pathogen.

NAD depletion as pathogen response One way that plants respond to pathogen infection is by sacrificing the infected cells. The nucleotide-binding leucine-rich repeat immune receptors responsible for this hypersensitive response carry Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domains. In two papers, Horsefield et al. and Wan et al. report that these TIR domains cleave the metabolic cofactor nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) as part of their cell-death signaling in response to pathogens. Similar signaling links mammalian TIR-containing proteins to NAD + depletion during Wallerian degeneration of neurons. Science , this issue p. 793 , p. 799

The Linum usitatissimum (flax) L gene alleles, which encode nucleotide binding site–Leu rich repeat class intracellular receptor proteins, confer resistance against the Melampsora lini (flax rust) fungus. At least 11 different L resistance specificities are known, and the corresponding avirulence genes in M. lini map to eight independent loci, some of which are complex and encode multiple specificities. We identified an M. lini cDNA marker that cosegregates in an F2 rust family with a complex locus determining avirulence on the L5, L6, and L7 resistance genes. Two related avirulence gene candidates, designated AvrL567-A and AvrL567-B, were identified in a genomic DNA contig from the avirulence allele, whereas the corresponding virulence allele contained a single copy of a related gene, AvrL567-C. Agrobacterium tumefaciens–mediated transient expression of the mature AvrL567-A or AvrL567-B (but not AvrL567-C) proteins as intracellular products in L. usitatissimum and Nicotiana tabacum (tobacco) induced a hypersensitive response–like necrosis that was dependent on coexpression of the L5, L6, or L7 resistance gene. An F1 seedling lethal or stunted growth phenotype also was observed when transgenic L. usitatissimum plants expressing AvrL567-A or AvrL567-B (but not AvrL567-C) were crossed to resistant lines containing L5, L6, or L7. The AvrL567 genes are expressed in rust haustoria and encode 127 amino acid secreted proteins. Intracellular recognition of these rust avirulence proteins implies that they are delivered into host cells across the plant membrane. Differences in the three AvrL567 protein sequences result from diversifying selection, which is consistent with a coevolutionary arms race.

Eukaryotic filamentous plant pathogens secrete effector proteins that modulate the host cell to facilitate infection. Computational effector candidate identification and subsequent functional characterization delivers valuable insights into plant-pathogen interactions. However, effector prediction in fungi has been challenging due to a lack of unifying sequence features such as conserved N-terminal sequence motifs. Fungal effectors are commonly predicted from secretomes based on criteria such as small size and cysteine-rich, which suffers from poor accuracy. We present EffectorP which pioneers the application of machine learning to fungal effector prediction. EffectorP improves fungal effector prediction from secretomes based on a robust signal of sequence-derived properties, achieving sensitivity and specificity of over 80%. Features that discriminate fungal effectors from secreted noneffectors are predominantly sequence length, molecular weight and protein net charge, as well as cysteine, serine and tryptophan content. We demonstrate that EffectorP is powerful when combined with in planta expression data for predicting high-priority effector candidates. EffectorP is the first prediction program for fungal effectors based on machine learning. Our findings will facilitate functional fungal effector studies and improve our understanding of effectors in plant-pathogen interactions. EffectorP is available at http://effectorp.csiro.au.

Pathogens secrete effector proteins and many operate inside plant cells to enable infection. Some effectors have been found to enter subcellular compartments by mimicking host targeting sequences. Although many computational methods exist to predict plant protein subcellular localization, they perform poorly for effectors. We introduce LOCALIZER for predicting plant and effector protein localization to chloroplasts, mitochondria, and nuclei. LOCALIZER shows greater prediction accuracy for chloroplast and mitochondrial targeting compared to other methods for 652 plant proteins. For 107 eukaryotic effectors, LOCALIZER outperforms other methods and predicts a previously unrecognized chloroplast transit peptide for the ToxA effector, which we show translocates into tobacco chloroplasts. Secretome-wide predictions and confocal microscopy reveal that rust fungi might have evolved multiple effectors that target chloroplasts or nuclei. LOCALIZER is the first method for predicting effector localisation in plants and is a valuable tool for prioritizing effector candidates for functional investigations. LOCALIZER is available at http://localizer.csiro.au/.

Plant-pathogenic fungi secrete effector proteins to facilitate infection. We describe extensive improvements to EffectorP, the first machine learning classifier for fungal effector prediction. EffectorP 2.0 is now trained on a larger set of effectors and utilizes a different approach based on an ensemble of classifiers trained on different subsets of negative data, offering different views on classification. EffectorP 2.0 achieves an accuracy of 89%, compared with 82% for EffectorP 1.0 and 59.8% for a small size classifier. Important features for effector prediction appear to be protein size, protein net charge as well as the amino acids serine and cysteine. EffectorP 2.0 decreases the number of predicted effectors in secretomes of fungal plant symbionts and saprophytes by 40% when compared with EffectorP 1.0. However, EffectorP 1.0 retains value, and combining EffectorP 1.0 and 2.0 results in a stringent classifier with a low false positive rate of 9%. EffectorP 2.0 predicts significant enrichments of effectors in 12 of 13 sets of infection-induced proteins from diverse fungal pathogens, whereas a small cysteine-rich classifier detects enrichment in only seven of 13. EffectorP 2.0 will fast track the prioritization of high-confidence effector candidates for functional validation and aid in improving our understanding of effector biology. EffectorP 2.0 is available at http://effectorp.csiro.au.