The laboratory mouse shares the majority of its protein-coding genes with humans, making it the premier model organism in biomedical research, yet the two mammals differ in significant ways. To gain greater insights into both shared and species-specific transcriptional and cellular regulatory programs in the mouse, the Mouse ENCODE Consortium has mapped transcription, DNase I hypersensitivity, transcription factor binding, chromatin modifications and replication domains throughout the mouse genome in diverse cell and tissue types. By comparing with the human genome, we not only confirm substantial conservation in the newly annotated potential functional sequences, but also find a large degree of divergence of sequences involved in transcriptional regulation, chromatin state and higher order chromatin organization. Our results illuminate the wide range of evolutionary forces acting on genes and their regulatory regions, and provide a general resource for research into mammalian biology and mechanisms of human diseases.

Abstract The human and mouse genomes contain instructions that specify RNAs and proteins and govern the timing, magnitude, and cellular context of their production. To better delineate these elements, phase III of the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) Project has expanded analysis of the cell and tissue repertoires of RNA transcription, chromatin structure and modification, DNA methylation, chromatin looping, and occupancy by transcription factors and RNA-binding proteins. Here we summarize these efforts, which have produced 5,992 new experimental datasets, including systematic determinations across mouse fetal development. All data are available through the ENCODE data portal ( https://www.encodeproject.org ), including phase II ENCODE 1 and Roadmap Epigenomics 2 data. We have developed a registry of 926,535 human and 339,815 mouse candidate cis -regulatory elements, covering 7.9 and 3.4% of their respective genomes, by integrating selected datatypes associated with gene regulation, and constructed a web-based server (SCREEN; http://screen.encodeproject.org ) to provide flexible, user-defined access to this resource. Collectively, the ENCODE data and registry provide an expansive resource for the scientific community to build a better understanding of the organization and function of the human and mouse genomes.

Abstract Dysregulation and enhanced expression of MYC transcription factors (TFs) including MYC and MYCN contribute to the majority of human cancers. For example, MYCN is amplified up to several hundred-fold in high-risk neuroblastoma. The resulting overexpression of N-myc aberrantly activates genes that are not activated at low N-myc levels and drives proliferation and cell survival. Whether increasing N-myc levels simply mediate binding to lower-affinity binding sites in the genome or fundamentally changes the activation process remains unclear. One such activation mechanism that could become important above threshold levels of N-myc is the formation of aberrant transcriptional condensates through phase separation. Phase separation has recently been linked to transcriptional regulation, but how strongly it contributes to gene activation remains unclear. Here we characterized the phase behavior of N-myc and showed that it can form dynamic condensates that bear the hallmarks of transcriptional activity. We tested the contribution of phase separation to N-myc-mediated gene expression by using a chemogenetic tool that allowed us to compare non-phase-separated and phase-separated conditions at identical N-myc levels, which both showed a strong impact on gene expression compared to no N-myc expression. However, we found that only a small fraction of <3% of N-myc-regulated genes is further affected by phase separation, but that these events include the activation of key oncogenes and the repression of tumor suppressors. Indeed, phase separation increases cell survival by ∼15% corroborating the biological effects of the transcriptional changes. However, our results also show that >97% of N-myc-regulated genes are not affected by N-myc phase separation, highlighting that transcription can be activated effectively by diffuse complexes of TFs with the transcriptional machinery.

Abstract Lineage-specific epigenomic changes during human corticogenesis have previously remained elusive due to challenges with tissue heterogeneity and sample availability. Here, we analyze cis-regulatory chromatin interactions, open chromatin regions, and transcriptomes for radial glia, intermediate progenitor cells, excitatory neurons, and interneurons isolated from mid-gestational human brain samples. We show that chromatin looping underlies transcriptional regulation for lineage-specific genes, with transcription factor motifs, families of transposable elements, and disease-associated variants enriched at distal interacting regions in a cell type-specific manner. A subset of promoters exhibit unusually high degrees of chromatin interactivity, which we term super interactive promoters. Super interactive promoters are enriched for critical lineage-specific genes, suggesting that interactions at these loci contribute to the fine-tuning of cell type-specific transcription. Finally, we present CRISPRview, a novel approach for validating distal interacting regions in primary cells. Our study presents the first characterization of cell type-specific 3D epigenomic landscapes during human corticogenesis, advancing our understanding of gene regulation and lineage specification during human brain development.

Abstract Genome-wide association studies (GWAS) have identified thousands of non-coding variants that contribute to psychiatric disease risks, likely by perturbing cis -regulatory elements (CREs). However, our ability to interpret and explore their mechanisms of action is hampered by a lack of annotation of functional CREs (fCREs) in neural cell types. Here, through genome-scale CRISPR screens of 22,000 candidate CREs (cCREs) in human induced pluripotent stem cells (iPSCs) undergoing differentiation to excitatory neurons, we identify 2,847 and 5,540 fCREs essential for iPSC fitness and neuronal differentiation, respectively. These fCREs display dynamic epigenomic features and exhibit increased numbers and genomic spans of chromatin interactions following terminal neuronal differentiation. Furthermore, fCREs essential for neuronal differentiation show significantly greater enrichment of genetic heritability for neurodevelopmental diseases including schizophrenia (SCZ), attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), and autism spectrum disorders (ASD) than cCREs. Using high-throughput prime editing screens we experimentally confirm 45 SCZ risk variants that act by affecting the function of fCREs. The extensive and in-depth functional annotation of cCREs in neuronal types therefore provides a crucial resource for interpreting non-coding risk variants of neuropsychiatric disorders.

Abstract Current pooled CRISPR screens for cis -regulatory elements (CREs) can only accommodate one gene based on its expression level. Here, we describe CRISPRpath, a scalable screening strategy for parallelly characterizing CREs of genes linked to the same biological pathway and converging phenotypes. We demonstrate the ability of CRISPRpath for simultaneously identifying functional enhancers of six genes in the 6-thioguanine-induced DNA mismatch repair pathway using both CRISPR interference (CRISPRi) and CRISPR nuclease (CRISPRn) approaches. 60% of the identified enhancers are known promoters with distinct epigenomic features compared to other active promoters, including increased chromatin accessibility and interactivity. Furthermore, by imposing different levels of selection pressure, CRISPRpath can distinguish enhancers exerting strong impact on gene expression from those exerting weak impact. Our results offer a nuanced view of cis -regulation and demonstrate that CRISPRpath can be leveraged for understanding the complex gene regulatory program beyond transcriptional output at scale.

Clustering is an essential step in the analysis of single cell RNA-seq (scRNA-seq) data to shed light on tissue complexity including the number of cell types and transcriptomic signatures of each cell type. Due to its importance, novel methods have been developed recently for this purpose. However, different approaches generate varying estimates regarding the number of clusters and the single-cell level cluster assignments. This type of unsupervised clustering is challenging and it is often times hard to gauge which method to use because none of the existing methods outperform others across all scenarios. We present SAME-clustering, a mixture model-based approach that takes clustering solutions from multiple methods and selects a maximally diverse subset to produce an improved ensemble solution. We tested SAME-clustering across 15 scRNA-seq datasets generated by different platforms, with number of clusters varying from 3 to 15, and number of single cells from 49 to 32,695. Results show that our SAME-clustering ensemble method yields enhanced clustering, in terms of both cluster assignments and number of clusters. The mixture model ensemble clustering is not limited to clustering scRNA-seq data and may be useful to a wide range of clustering applications.

SUMMARY We uncovered a transcription factor (TF) network that regulates cortical regional patterning. Screening the expression of hundreds of TFs in the developing mouse cortex identified 38 TFs that are expressed in gradients in the ventricular zone (VZ). We tested whether their cortical expression was altered in mutant mice with known patterning defects ( Emx2, Nr2f1 and Pax6) , which enabled us to define a cortical regionalization TF network (CRTFN). To identify genomic programming underlying this network, we performed TF ChIP-seq and chromatin-looping conformation to identify enhancer-gene interactions. To map enhancers involved in regional patterning of cortical progenitors, we performed assays for epigenomic marks and DNA accessibility in VZ cells purified from wild-type and patterning mutant mice. This integrated approach has identified a CRTFN and VZ enhancers involved in cortical regional patterning.

Microglia are resident immune cells that play critical roles in maintaining normal physiology of the central nervous system. Remarkably, microglia have intrinsic capacity to replenish after being acutely ablated. However, the underlying mechanisms that drive such microglial restoration remain elusive. Here, we removed microglia via CSF1R inhibitor PLX5622 and characterized repopulation both spatially and temporally. We also investigated the cellular origin of repopulated microglia and report that microglia are replenished via self-renewal, with little contribution from non-microglial lineage progenitors, including nestin+ progenitors and the circulating myeloid population. Interestingly, spatial analyses with multi-color labeling reveal that newborn microglia recolonize the parenchyma by forming distinctive clusters that maintain stable territorial boundaries over time, indicating proximal expansion nature of adult microgliogenesis and stability of microglia tiling. Temporal transcriptome profiling from newborn microglia at different repopulation stages revealed that the adult newborn microglia gradually regain steady-state maturity from an immature state that is reminiscent of neonatal stage and follow a series of maturation programs that include NF-kB activation, interferon immune activation and apoptosis, etc. Importantly, we show that the restoration of microglial homeostatic density requires NF-kB signaling as well as apoptotic egress of excessive cells. In summary, our study reports key events that take place from microgliogenesis to homeostasis re-establishment.

ABSTRACT Transcription factors (TFs) bind combinatorially to genomic cis-regulatory elements (cREs), orchestrating transcription programs. While studies of chromatin state and chromosomal interactions have revealed dynamic neurodevelopmental cRE landscapes, parallel understanding of the underlying TF binding lags. To elucidate the combinatorial TF-cRE interactions driving mouse basal ganglia development, we integrated ChIP-seq for twelve TFs, H3K4me3-associated enhancer-promoter interactions, chromatin and transcriptional state, and transgenic enhancer assays. We identified TF-cREs modules with distinct chromatin features and enhancer activity that have complementary roles driving GABAergic neurogenesis and suppressing other developmental fates. While the majority of distal cREs were bound by one or two TFs, a small proportion were extensively bound, and these enhancers also exhibited exceptional evolutionary conservation, motif density, and complex chromosomal interactions. Our results provide new insights into how modules of combinatorial TF-cRE interactions activate and repress developmental expression programs and demonstrate the value of TF binding data in modeling gene regulatory wiring.