TopHat is a popular spliced aligner for RNA-sequence (RNA-seq) experiments. In this paper, we describe TopHat2, which incorporates many significant enhancements to TopHat. TopHat2 can align reads of various lengths produced by the latest sequencing technologies, while allowing for variable-length indels with respect to the reference genome. In addition to de novo spliced alignment, TopHat2 can align reads across fusion breaks, which can occur after genomic translocations. TopHat2 combines the ability to identify novel splice sites with direct mapping to known transcripts, producing sensitive and accurate alignments, even for highly repetitive genomes or in the presence of pseudogenes. TopHat2 is available at http://ccb.jhu.edu/software/tophat .

Recent advances in high-throughput cDNA sequencing (RNA-seq) can reveal new genes and splice variants and quantify expression genome-wide in a single assay. The volume and complexity of data from RNA-seq experiments necessitate scalable, fast and mathematically principled analysis software. TopHat and Cufflinks are free, open-source software tools for gene discovery and comprehensive expression analysis of high-throughput mRNA sequencing (RNA-seq) data. Together, they allow biologists to identify new genes and new splice variants of known ones, as well as compare gene and transcript expression under two or more conditions. This protocol describes in detail how to use TopHat and Cufflinks to perform such analyses. It also covers several accessory tools and utilities that aid in managing data, including CummeRbund, a tool for visualizing RNA-seq analysis results. Although the procedure assumes basic informatics skills, these tools assume little to no background with RNA-seq analysis and are meant for novices and experts alike. The protocol begins with raw sequencing reads and produces a transcriptome assembly, lists of differentially expressed and regulated genes and transcripts, and publication-quality visualizations of analysis results. The protocol's execution time depends on the volume of transcriptome sequencing data and available computing resources but takes less than 1 d of computer time for typical experiments and ∼1 h of hands-on time.

By using bootstraps that estimate inferential variance, the sleuth method and software provide fast and highly accurate differential gene expression analysis in an interactive Shiny app. We describe sleuth ( http://pachterlab.github.io/sleuth ), a method for the differential analysis of gene expression data that utilizes bootstrapping in conjunction with response error linear modeling to decouple biological variance from inferential variance. sleuth is implemented in an interactive shiny app that utilizes kallisto quantifications and bootstraps for fast and accurate analysis of data from RNA-seq experiments.

Abstract Summary: We describe a new ‘reference annotation based transcript assembly’ problem for RNA-Seq data that involves assembling novel transcripts in the context of an existing annotation. This problem arises in the analysis of expression in model organisms, where it is desirable to leverage existing annotations for discovering novel transcripts. We present an algorithm for reference annotation-based transcript assembly and show how it can be used to rapidly investigate novel transcripts revealed by RNA-Seq in comparison with a reference annotation. Availability: The methods described in this article are implemented in the Cufflinks suite of software for RNA-Seq, freely available from http://bio.math.berkeley.edu/cufflinks. The software is released under the BOOST license. Contact: cole@broadinstitute.org; lpachter@math.berkeley.edu Supplementary Information: Supplementary data are available at Bioinformatics online.

Neoepitopes derived from intron retention events are processed and presented on MHC I in cancer cell lines. We present an in silico approach to identifying neoepitopes derived from intron retention events in tumor transcriptomes. Using mass spectrometry immunopeptidome analysis, we show that retained intron neoepitopes are processed and presented on MHC I on the surface of cancer cell lines. RNA-derived neoepitopes should be considered for prospective personalized cancer vaccine development.

Abstract Gene-level differential expression analysis based on RNA-Seq is more robust, powerful and biologically actionable than transcript-level differential analysis. However aggregation of transcript counts prior to analysis results can mask transcript-level dynamics. We demonstrate that aggregating the results of transcript-level analysis allow for gene-level analysis with transcript-level resolution. We also show that p -value aggregation methods, typically used for meta-analyses, greatly increase the sensitivity of gene-level differential analyses. Furthermore, such aggregation can be applied directly to transcript compatibility counts obtained during pseudoalignment, thereby allowing for rapid and accurate model-free differential testing. The methods are general, allowing for testing not only of genes but also of any groups of transcripts, and we showcase an example where we apply them to perturbation analysis of gene ontologies.

Abstract Despite the growing number of genome-wide association studies (GWAS), it remains unclear to what extent gene-by-gene and gene-by-environment interactions influence complex traits in humans. The magnitude of genetic interactions in complex traits has been difficult to quantify because GWAS are generally underpowered to detect individual interactions of small effect. Here, we develop a method to test for genetic interactions that aggregates information across all trait-associated loci. Specifically, we test whether SNPs in regions of European ancestry shared between European American and admixed African American individuals have the same causal effect sizes. We hypothesize that in African Americans, the presence of genetic interactions will drive the causal effect sizes of SNPs in regions of European ancestry to be more similar to those of SNPs in regions of African ancestry. We apply our method to two traits: gene expression in 296 African Americans and 482 European Americans in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) in 74K African Americans and 296K European Americans in the Million Veteran Program (MVP). We find significant evidence for genetic interactions in our analysis of gene expression; for LDL-C, we observe a similar point estimate although this is not significant, likely due to lower statistical power. These results suggest that gene-by-gene or gene-by-environment interactions modify the effect sizes of causal variants in human complex traits.

Abstract Deep mutational scanning (DMS) measures the effects of thousands of genetic variants in a protein simultaneously. The small sample size renders classical statistical methods ineffective. For example, p -values cannot be correctly calibrated when treating variants independently. We propose , a Bayesian framework for analyzing growth-based DMS data. leverages amino acid position information to increase power and control the false discovery rate by sharing information across parameters via shrinkage. We also developed for simulating the distributional properties of DMS. We show that is robust to the violation of model assumptions and is more powerful than existing tools.

Abstract CRISPR screens are powerful tools to identify key genes that underlie biological processes. One important type of screen uses fluorescence activated cell sorting (FACS) to sort perturbed cells into bins based on the expression level of marker genes, followed by guide RNA (gRNA) sequencing. Analysis of these data presents several statistical challenges due to multiple factors including the discrete nature of the bins and typically small numbers of replicate experiments. To address these challenges, we developed a robust and powerful Bayesian random effects model and software package called Waterbear. Furthermore, we used Waterbear to explore how various experimental design parameters affect statistical power to establish principled guidelines for future screens. Finally, we experimentally validated our experimental design model findings that, when using Waterbear for analysis, high power is maintained even at low cell coverage and a high multiplicity of infection. We anticipate that Waterbear will be of broad utility for analyzing FACS-based CRISPR screens.