De novo assembly of short RNA-Seq reads into transcripts is challenging due to sequence similarities in transcriptomes arising from gene duplications and alternative splicing of transcripts. We present Shannon, an RNA-Seq assembler with an optimality guarantee derived from principles of information theory: Shannon reconstructs nearly all information-theoretically reconstructable transcripts. Shannon is based on a theory we develop for de novo RNA-Seq assembly that reveals differing abundances among transcripts to be the key, rather than the barrier, to effective assembly. The assembly problem is formulated as a sparsest-flow problem on a transcript graph, and the heart of Shannon is a novel iterative flow-decomposition algorithm. This algorithm provably solves the information-theoretically reconstructable instances in linear-time even though the general sparsest-flow problem is NP-hard. Shannon also incorporates several additional new algorithmic advances: a new error-correction algorithm based on successive cancelation, a multi-bridging algorithm that carefully utilizes read information in the k-mer de Bruijn graph, and an approximate graph partitioning algorithm to split the transcriptome de Bruijn graph into smaller components. In tests on large RNA-Seq datasets, Shannon obtains significant increases in sensitivity along with improvements in specificity in comparison to state-of-the-art assemblers.

Abstract Gene-level differential expression analysis based on RNA-Seq is more robust, powerful and biologically actionable than transcript-level differential analysis. However aggregation of transcript counts prior to analysis results can mask transcript-level dynamics. We demonstrate that aggregating the results of transcript-level analysis allow for gene-level analysis with transcript-level resolution. We also show that p -value aggregation methods, typically used for meta-analyses, greatly increase the sensitivity of gene-level differential analyses. Furthermore, such aggregation can be applied directly to transcript compatibility counts obtained during pseudoalignment, thereby allowing for rapid and accurate model-free differential testing. The methods are general, allowing for testing not only of genes but also of any groups of transcripts, and we showcase an example where we apply them to perturbation analysis of gene ontologies.

Abstract We present an organism-wide, transcriptomic cell atlas of the hydrozoan medusa Clytia hemisphaerica , and determine how its component cell types respond to starvation. Utilizing multiplexed scRNA-seq, in which individual animals were indexed and pooled from control and perturbation conditions into a single sequencing run, we avoid artifacts from batch effects and are able to discern shifts in cell state in response to organismal perturbations. This work serves as a foundation for future studies of development, function, and plasticity in a genetically tractable jellyfish species. Moreover, we introduce a powerful workflow for high-resolution, wh ole a nimal, m ultiplexed single-cell genomics (WHAM-seq) that is readily adaptable to other traditional or non-traditional model organisms.

Synonymous codon choice can have dramatic effects on ribosome speed, RNA stability, and protein expression. Ribosome profiling experiments have underscored that ribosomes do not move uniformly along mRNAs, exposing a need for models of coding sequences that capture the full range of empirically observed variation. We present a method, Ixnos, that models this variation in translation elongation using a feedforward neural network to predict the translation elongation rate at each codon as a function of its sequence neighborhood. Our approach revealed sequence features affecting translation elongation and quantified the impact of large technical biases in ribosome profiling. We applied our model to design synonymous variants of a fluorescent protein spanning the range of possible translation speeds predicted with our model. We found that levels of the fluorescent protein in yeast closely tracked the predicted translation speeds across their full range. We therefore demonstrate that our model captures information determining translation dynamics in vivo , and that control of translation elongation alone is sufficient to produce large, quantitative differences in protein output.

Genome wide association studies (GWAS) rely on microarrays, or more recently mapping of whole-genome sequencing reads, to genotype individuals. The reliance on prior sequencing of a reference genome for the organism on which the association study is to be performed limits the scope of association studies, and also precludes the identification of differences between cases and controls outside of the reference. We present an alignment free method for association studies that is based on counting k-mers in sequencing reads, testing for associations directly between k-mers and the trait of interest, and local assembly of the statistically significant k-mers to identify sequence differences. Results with simulated data and an analysis of the 1000 genomes data provide a proof of principle for the approach. In a pairwise comparison of the Toscani in Italia (TSI) and the Yoruba in Ibadan, Nigeria (YRI) populations we find that sequences identified by our method largely agree with results obtained using standard GWAS based on variant calling from mapped reads. However unlike standard GWAS, we find that our method identifies associations with structural variations and sites not present in the reference genome revealing sequences absent from the human reference genome. We also analyze data from the Bengali from Bangladesh (BEB) population to explore possible genetic basis of high rate of mortality due to cardiovascular diseases (CVD) among South Asians and find significant differences in frequencies of a number of non-synonymous variants in genes linked to CVDs between BEB and TSI samples, including the site rs1042034, which has been associated with higher risk of CVDs previously and the nearby rs676210 in the Apolipoprotein B (ApoB) gene.

Single-cell sequencing experiments use short DNA barcode "tags" to identify reads that originate from the same cell. In order to recover single-cell information from such experiments, reads must be grouped based on their barcode tag, a crucial processing step that precedes other computations. However, this step can be difficult due to high rates of mismatch and deletion errors that can afflict barcodes. Here we present an approach to identify and error-correct barcodes by traversing the de Bruijn graph of circularized barcode k-mers. This allows for assignment of reads to consensus fingerprints constructed from k-mers, and we show that for single-cell RNA-Seq this improves the recovery of accurate single-cell transcriptome estimates.

Current approaches to single-cell transcriptomic analysis are computationally intensive and require assay-specific modeling which limit their scope and generality. We propose a novel method that departs from standard analysis pipelines, comparing and clustering cells based not on their transcript or gene quantifications but on their transcript-compatibility read counts. In re-analysis of two landmark yet disparate single-cell RNA-Seq datasets, we show that our method is up to two orders of magnitude faster than previous approaches, provides accurate and in some cases improved results, and is directly applicable to data from a wide variety of assays.

Pioneer factors such as Zelda help initiate zygotic transcription in Drosophila early embryos, but whether other factors support this dynamic process is unclear. Odd-paired (Opa), a zinc-finger transcription factor expressed at cellularization, controls transition of genes from pair-rule to segmental patterns along the anterior-posterior axis. Finding that Opa also regulates late expression through enhancer sog\_Distal, along the dorso-ventral axis, we hypothesized that Opa acts as a general timing factor. Chromatin-immunoprecipitation (ChIP-seq) confirmed Opa in vivo binding to sog\_Distal but also identified widespread binding throughout the genome, comparable to Zelda. Furthermore, chromatin assays (ATAC-seq) demonstrate that Opa, like Zelda, influences chromatin accessibility genome-wide, suggesting both are pioneer factors with common as well as distinct targets. Lastly, embryos lacking opa exhibit widespread, late patterning defects spanning both axes. Collectively, these data suggest Opa, a general timing factor and likely a late-acting pioneer factor, heralds in a secondary wave of zygotic gene expression.

A number of high-throughput transcriptase drop-off assays have recently been developed to probe post-transcriptional dynamics of RNA-protein interaction, RNA structure, and post-transcriptional modifications. Although these assays survey a diverse set of 'epitranscriptomic' marks, they share methodological similarities and as such their interpretation is predicated on addressing similar computational challenges. Among these, a key question is how to learn isoform-specific chemical modification profiles in the face of complex read multi-mapping. In this paper, we propose PROBer, the first rigorous statistical model to handle these challenges for a general set of sequencing-based 'toeprinting' assays.

Scaffolding i.e. ordering and orienting contigs is an important step in genome assembly. We present a method for scaffolding based on likelihoods of genome assemblies. Generative models for sequencing are used to obtain maximum likelihood estimates of gaps between contigs and to estimate whether linking contigs into scaffolds would lead to an increase in the likelihood of the assembly. We then link contigs if they can be unambiguously joined or if the corresponding increase in likelihood is substantially greater than that of other possible joins of those contigs. The method is implemented in a tool called SWALO with approximations to make it efficient and applicable to large datasets. Analysis on real and simulated datasets reveals that it consistently makes more or similar number of correct joins as other scaffolders while linking very few contigs incorrectly, thus outperforming other scaffolders and demonstrating that substantial improvement in genome assembly may be achieved through the use of statistical models. SWALO is freely available for download at https://atifrahman.github.io/SWALO/.