The misfolding and self-assembly of proteins into β-sheet-rich amyloid fibrils of various structures and morphologies is a hallmark of several neurodegenerative and systemic diseases. Increasing evidence suggests that amyloid polymorphism gives rise to different strains of amyloids with distinct toxicity and pathology-spreading properties. Validating this hypothesis is challenging due to a lack of tools and methods that allow for the direct characterization of amyloid polymorphism in hydrated and complex biological samples. Here, we report on the use of 11-mercapto-1-undecanesulfonate-coated gold nanoparticles (NPs) to label the edges of synthetic, recombinant and native amyloid fibrils to assess amyloid morphological polymorphism using cryogenic transmission electron microscopy (cryo TEM). The fibrils studied were derived from amyloid proteins involved in disorders of the central nervous system (amyloid-β, tau, α-synuclein) and in systemic amyloidosis (a fragment of an immunoglobulin light chain). The labeling efficiency enabled imaging and characterization of amyloid fibrils of different morphologies under hydrated conditions using cryo TEM. These NPs allowed for the visualization of morphological features that are not directly observed using standard imaging techniques, including TEM with use of the negative stain or cryo TEM imaging. We also demonstrate the use of these NPs to label native paired helical filaments (PHFs) from the postmortem brain of an Alzheimer's disease patient, as well as amyloid fibrils extracted from the heart tissue of a patient suffering from systemic amyloid light-chain (AL) amyloidosis. Analysis of the cryo TEM images of amyloids decorated with NPs shows exceptional homogeneity across the fibrils derived from human tissue in comparison to fibrils aggregated in vitro. The use of these NPs enabled us to gain novel insight into the structural features that distinguish amyloid fibrils formed in vivo from those formed in cell-free in vitro systems. Our findings demonstrate that these NPs represent a potent tool for rapid imaging and profiling of amyloid morphological polymorphism in different types of samples, including those derived from complex biological aggregates found in human tissue and animal models of amyloid diseases. This study should not only facilitate the profiling and characterization of amyloids for structural studies by cryo TEM but also pave the way to elucidate the structural basis of amyloid strains and toxicity and possibly the correlation between the pathological and clinical heterogeneity of amyloid diseases.

The microtubule-associated protein Tau is implicated in the pathogenesis of several neurodegenerative disorders, including Alzheimer’s disease. Increasing evidence suggests that post-translational modifications play critical roles in regulating Tau normal functions and its pathogenic properties in Tauopathies. Very little is known about how phosphorylation of tyrosine residues influences the structure, aggregation, and microtubule- and lipid-binding properties of Tau. In this work, we aimed to address this knowledge gap and determine the relative contribution of phosphorylation of one or several of the five tyrosine residues in Tau (Y18, Y29, Y197, Y310 and Y394) to the regulation of its biophysical, aggregation and functional properties. Towards this goal, we used a combination of site-specific mutagenesis and in vitro phosphorylation by c-Abl kinase to generate Tau species phosphorylated at all tyrosine residues, all tyrosine residues except Y310 or Y394 (pTau-Y310F, pTau-Y394F) and Tau phosphorylated only at Y310 or Y394 (4F\pY310 or 4F\pY394). Our results show that phosphorylation at all five tyrosine residues, multiple N-terminal tyrosine residues (Y18, Y29 and Y197) or site-specific phosphorylation at residue Y310, itself located in the microtubule-binding and aggregation-prone domain of Tau, was sufficient to abolish Tau aggregation and inhibit its microtubule- and lipid-binding properties. NMR studies demonstrated that these effects were mediated by a local decrease in β−sheet propensity of the PHF6 domain. Our findings underscore the unique role of Y310 phosphorylation in the regulation of Tau aggregation, microtubule and lipid interactions and highlight the importance of conducting further studies to elucidate its role in the regulation of Tau normal functions and its pathogenic properties.* Abl : Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 AD : Alzheimer’s disease Arg : Abelson tyrosine-protein kinase 2 BPS : brain phosphatidylserine CBD : corticobasal degeneration CD : circular dichroism CTE : chronic traumatic encephalopathy EM : electron microscopy fPS : fluorescent phospholipids FTDP-17 : frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17 GTP : guanosine triphosphate HSCQS : heteronuclear single quantum coherence spectroscopy LC/MS : liquid chromatography–mass spectrometry MAPF : microtubule−associated protein fraction MS/MS : tandem mass spectrometry MT : microtubule MTBD : microtubule-binding domain MTBR : microtubule-binding region NBD : nitrobenzoxadiazole NFT : neurofibrillary tangle NMR : nuclear magnetic resonance PD : Parkinson’s disease pS : phospho-serine PSP : progressive supranuclear palsy pT : phospho-threonines PTM : post-translational modification pY : phospho-tyrosine RP−HPLC : reversed phase high-performance liquid chromatography RT : room temperature SD : standard deviation SDS-PAGE : sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis SP : spectral count ssi : secondary shift index Syk : Spleen tyrosine kinase ThT : thioflavin T TTBK1 : Tau tubulin kinase 1 UPLC : ultra performance liquid chromatography WT : wild-type

Although converging evidence point to alpha-synuclein (a-syn) aggregation and Lewy body (LB) formation as central events in Parkinson's disease (PD), the molecular mechanisms that regulate these processes and their role in disease pathogenesis remain poorly understood. Herein, we applied an integrative biochemical, structural and imaging approach to elucidate the sequence, molecular and cellular mechanisms that regulate LB formation in primary neurons. Our results establish that post-fibrillization C-terminal truncation mediated by calpains 1 and 2 and potentially other enzymes, plays critical roles in regulating a-syn seeding, fibrillization and orchestrates many of the events associated with LB formation and maturation. These findings combined with the abundance of a-syn truncated species in LBs and pathological a-syn aggregates have significant implications for ongoing efforts to develop therapeutic strategies based on targeting the C-terminus of a-syn or proteolytic processing of this region.