Alzheimer's and Parkinson's diseases are associated with the formation in the brain of amyloid fibrils from beta-amyloid and alpha-synuclein proteins, respectively. It is likely that oligomeric fibrillization intermediates (protofibrils), rather than the fibrils themselves, are pathogenic, but the mechanism by which they cause neuronal death remains a mystery. We show here that mutant amyloid proteins associated with familial Alzheimer's and Parkinson's diseases form morphologically indistinguishable annular protofibrils that resemble a class of pore-forming bacterial toxins, suggesting that inappropriate membrane permeabilization might be the cause of cell dysfunction and even cell death in amyloid diseases.

Two mutations in the α-synuclein gene (A30P and A53T) have been linked to autosomal dominant early-onset Parkinson's disease (PD). Both mutations promote the formation of transient protofibrils (prefibrillar oligomers), suggesting that protofibrils are linked to cytotoxicity. In this work, the effect of these mutations on the structure of α-synuclein oligomers was investigated using electron microscopy and digital image processing. The PD-linked mutations (A30P and A53T) were observed to affect both the morphology and the size distribution of α-synuclein protofibrils (measured by analytical ultracentrifugation and scanning transmission electron microscopy). The A30P variant was observed to promote the formation of annular, pore-like protofibrils, whereas A53T promotes formation of annular and tubular protofibrillar structures. Wild-type α-synuclein also formed annular protofibrils, but only after extended incubation. The formation of pore-like oligomeric structures may explain the membrane permeabilization activity of α-synuclein protofibrils. These structures may contribute to the pathogenesis of PD.

The assumption that each enzyme expresses a single enzymatic activity in vivo is challenged by the linkage of the neuronal enzyme ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (UCH-L1) to Parkinson's disease (PD). UCH-L1, especially those variants linked to higher susceptibility to PD, causes the accumulation of α-synuclein in cultured cells, an effect that cannot be explained by its recognized hydrolase activity. UCH-L1 is shown here to exhibit a second, dimerization-dependent, ubiquityl ligase activity. A polymorphic variant of UCH-L1 that is associated with decreased PD risk (S18Y) has reduced ligase activity but comparable hydrolase activity as the wild-type enzyme. Thus, the ligase activity as well as the hydrolase activity of UCH-L1 may play a role in proteasomal protein degradation, a critical process for neuronal health.

Since the discovery and isolation of α-synuclein (α-syn) from human brains, it has been widely accepted that it exists as an intrinsically disordered monomeric protein. Two recent studies suggested that α-syn produced in Escherichia coli or isolated from mammalian cells and red blood cells exists predominantly as a tetramer that is rich in α-helical structure (Bartels, T., Choi, J. G., and Selkoe, D. J. (2011) Nature 477, 107–110; Wang, W., Perovic, I., Chittuluru, J., Kaganovich, A., Nguyen, L. T. T., Liao, J., Auclair, J. R., Johnson, D., Landeru, A., Simorellis, A. K., Ju, S., Cookson, M. R., Asturias, F. J., Agar, J. N., Webb, B. N., Kang, C., Ringe, D., Petsko, G. A., Pochapsky, T. C., and Hoang, Q. Q. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17797–17802). However, it remains unknown whether or not this putative tetramer is the main physiological form of α-syn in the brain. In this study, we investigated the oligomeric state of α-syn in mouse, rat, and human brains. To assess the conformational and oligomeric state of native α-syn in complex mixtures, we generated α-syn standards of known quaternary structure and conformational properties and compared the behavior of endogenously expressed α-syn to these standards using native and denaturing gel electrophoresis techniques, size-exclusion chromatography, and an oligomer-specific ELISA. Our findings demonstrate that both human and rodent α-syn expressed in the central nervous system exist predominantly as an unfolded monomer. Similar results were observed when human α-syn was expressed in mouse and rat brains as well as mammalian cell lines (HEK293, HeLa, and SH-SY5Y). Furthermore, we show that α-syn expressed in E. coli and purified under denaturing or nondenaturing conditions, whether as a free protein or as a fusion construct with GST, is monomeric and adopts a disordered conformation after GST removal. These results do not rule out the possibility that α-syn becomes structured upon interaction with other proteins and/or biological membranes. Since the discovery and isolation of α-synuclein (α-syn) from human brains, it has been widely accepted that it exists as an intrinsically disordered monomeric protein. Two recent studies suggested that α-syn produced in Escherichia coli or isolated from mammalian cells and red blood cells exists predominantly as a tetramer that is rich in α-helical structure (Bartels, T., Choi, J. G., and Selkoe, D. J. (2011) Nature 477, 107–110; Wang, W., Perovic, I., Chittuluru, J., Kaganovich, A., Nguyen, L. T. T., Liao, J., Auclair, J. R., Johnson, D., Landeru, A., Simorellis, A. K., Ju, S., Cookson, M. R., Asturias, F. J., Agar, J. N., Webb, B. N., Kang, C., Ringe, D., Petsko, G. A., Pochapsky, T. C., and Hoang, Q. Q. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17797–17802). However, it remains unknown whether or not this putative tetramer is the main physiological form of α-syn in the brain. In this study, we investigated the oligomeric state of α-syn in mouse, rat, and human brains. To assess the conformational and oligomeric state of native α-syn in complex mixtures, we generated α-syn standards of known quaternary structure and conformational properties and compared the behavior of endogenously expressed α-syn to these standards using native and denaturing gel electrophoresis techniques, size-exclusion chromatography, and an oligomer-specific ELISA. Our findings demonstrate that both human and rodent α-syn expressed in the central nervous system exist predominantly as an unfolded monomer. Similar results were observed when human α-syn was expressed in mouse and rat brains as well as mammalian cell lines (HEK293, HeLa, and SH-SY5Y). Furthermore, we show that α-syn expressed in E. coli and purified under denaturing or nondenaturing conditions, whether as a free protein or as a fusion construct with GST, is monomeric and adopts a disordered conformation after GST removal. These results do not rule out the possibility that α-syn becomes structured upon interaction with other proteins and/or biological membranes.

Parkinson’s disease (PD) is characterized by the accumulation of misfolded and aggregated α-synuclein (α-syn) into intraneuronal inclusions named Lewy bodies (LBs). Although it is widely believed that α-syn plays a central role in the pathogenesis of PD, the processes that govern α-syn fibrillization and LB formation remain poorly understood. In this work, we sought to dissect the spatiotemporal events involved in the biogenesis of the LBs at the genetic, molecular, biochemical, structural, and cellular levels. Toward this goal, we further developed a seeding-based model of α-syn fibrillization to generate a neuronal model that reproduces the key events leading to LB formation, including seeding, fibrillization, and the formation of inclusions that recapitulate many of the biochemical, structural, and organizational features of bona fide LBs. Using an integrative omics, biochemical and imaging approach, we dissected the molecular events associated with the different stages of LB formation and their contribution to neuronal dysfunction and degeneration. In addition, we demonstrate that LB formation involves a complex interplay between α-syn fibrillization, posttranslational modifications, and interactions between α-syn aggregates and membranous organelles, including mitochondria, the autophagosome, and endolysosome. Finally, we show that the process of LB formation, rather than simply fibril formation, is one of the major drivers of neurodegeneration through disruption of cellular functions and inducing mitochondria damage and deficits, and synaptic dysfunctions. We believe that this model represents a powerful platform to further investigate the mechanisms of LB formation and clearance and to screen and evaluate therapeutics targeting α-syn aggregation and LB formation.

α-Synuclein (α-syn) phosphorylation at serine 129 is characteristic of Parkinson disease (PD) and related α-synulceinopathies. However, whether phosphorylation promotes or inhibits α-syn aggregation and neurotoxicity in vivo remains unknown. This understanding is critical for elucidating the role of α-syn in the pathogenesis of PD and for development of therapeutic strategies for PD. To better understand the structural and molecular consequences of Ser-129 phosphorylation, we compared the biochemical, structural, and membrane binding properties of wild type α-syn to those of the phosphorylation mimics (S129E, S129D) as well as of in vitro phosphorylated α-syn using a battery of biophysical techniques. Our results demonstrate that phosphorylation at Ser-129 increases the conformational flexibility of α-syn and inhibits its fibrillogenesis in vitro but does not perturb its membrane-bound conformation. In addition, we show that the phosphorylation mimics (S129E/D) do not reproduce the effect of phosphorylation on the structural and aggregation properties of α-syn in vitro. Our findings have significant implications for current strategies to elucidate the role of phosphorylation in modulating protein structure and function in health and disease and provide novel insight into the underlying mechanisms that govern α-syn aggregation and toxicity in PD and related α-synulceinopathies. α-Synuclein (α-syn) phosphorylation at serine 129 is characteristic of Parkinson disease (PD) and related α-synulceinopathies. However, whether phosphorylation promotes or inhibits α-syn aggregation and neurotoxicity in vivo remains unknown. This understanding is critical for elucidating the role of α-syn in the pathogenesis of PD and for development of therapeutic strategies for PD. To better understand the structural and molecular consequences of Ser-129 phosphorylation, we compared the biochemical, structural, and membrane binding properties of wild type α-syn to those of the phosphorylation mimics (S129E, S129D) as well as of in vitro phosphorylated α-syn using a battery of biophysical techniques. Our results demonstrate that phosphorylation at Ser-129 increases the conformational flexibility of α-syn and inhibits its fibrillogenesis in vitro but does not perturb its membrane-bound conformation. In addition, we show that the phosphorylation mimics (S129E/D) do not reproduce the effect of phosphorylation on the structural and aggregation properties of α-syn in vitro. Our findings have significant implications for current strategies to elucidate the role of phosphorylation in modulating protein structure and function in health and disease and provide novel insight into the underlying mechanisms that govern α-syn aggregation and toxicity in PD and related α-synulceinopathies. Mounting evidence from pathologic, genetic, animal model, biochemical, and biophysical studies support the hypothesis that α-synuclein (α-syn) 3The abbreviations used are: α-syn, α-synuclein; PD, Parkinson disease; SEC, size exclusion chromatography; ThT, thioflavin T; TEM, transmission electron microscopy; MTSL, 1-oxy-2, 2, 5, 5-tetramethyl-d-pyrroline-3-methyl)-methanethiosulfonate; CK, casein kinase; POPG, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (sodium salt); MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight; HSQC, heteronuclear single quantum coherence; NOE, nuclear Overhauser effect; LB, Lewy body; WT, wild type; HPLC, high performance liquid chromatography; Bis-Tris, 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol; PBS, phosphate-buffered saline. plays a central role in the pathogenesis of Parkinson disease (PD) and several other neurodegenerative diseases, including Alzheimer disease, multiple system atrophy, dementia with Lewy bodies, Down syndrome, and neurodegeneration with brain iron accumulation, collectively referred to as “synucleinopathies” (1Trojanowski J.Q. Lee V.M. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 991: 107-110Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar). Although the exact function of α-syn remains poorly understood, it is thought to play a role in regulating dopamine neurotransmission (2Abeliovich A. Schmitz Y. Farinas I. Choi-Lundberg D. Ho W.H. Castillo P.E. Shinsky N. Verdugo J.M. Armanini M. Ryan A. Hynes M. Phillips H. Sulzer D. Rosenthal A. Neuron. 2000; 25: 239-252Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1403) Google Scholar), vesicular trafficking (3Cooper A.A. Gitler A.D. Cashikar A. Haynes C.M. Hill K.J. Bhullar B. Liu K. Xu K. Strathearn K.E. Liu F. Cao S. Caldwell K.A. Caldwell G.A. Marsischky G. Kolodner R.D. Labaer J. Rochet J.C. Bonini N.M. Lindquist S. Science. 2006; 313: 324-328Crossref PubMed Scopus (1080) Google Scholar, 4Outeiro T.F. Lindquist S. Science. 2003; 302: 1772-1775Crossref PubMed Scopus (624) Google Scholar), and modulating synaptic function and plasticity (5Kahle P.J. Neumann M. Ozmen L. Haass C. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000; 920: 33-41Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 6George J.M. Jin H. Woods W.S. Clayton D.F. Neuron. 1995; 15: 361-372Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (730) Google Scholar). Increasing evidence suggests that phosphorylation may be an important regulator of α-syn oligomerization, fibrillogenesis, Lewy body (LB) formation, and neurotoxicity in vivo (7Chen L. Feany M.B. Nat. Neurosci. 2005; 8: 657-663Crossref PubMed Scopus (525) Google Scholar). Immunohistochemical and biochemical studies suggest that the majority of α-syn within LBs from patients with PD and related synucleinopathies (8Fujiwara H. Hasegawa M. Dohmae N. Kawashima A. Masliah E. Goldberg M.S. Shen J. Takio K. Iwatsubo T. Nat. Cell Biol. 2002; 4: 160-164Crossref PubMed Scopus (159) Google Scholar, 9Anderson J.P. Walker D.E. Goldstein J.M. de Laat R. Banducci K. Caccavello R.J. Barbour R. Huang J. Kling K. Lee M. Diep L. Keim P.S. Shen X. Chataway T. Schlossmacher M.G. Seubert P. Schenk D. Sinha S. Gai W.P. Chilcote T.J. J. Biol. Chem. 2006; 281: 29739-29752Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (912) Google Scholar, 10Kahle P.J. Neumann M. Ozmen L. Muller V. Jacobsen H. Spooren W. Fuss B. Mallon B. Macklin W.B. Fujiwara H. Hasegawa M. Iwatsubo T. Kretzschmar H.A. Haass C. EMBO Rep. 2002; 3: 583-588Crossref PubMed Scopus (264) Google Scholar, 11Takahashi M. Kanuka H. Fujiwara H. Koyama A. Hasegawa M. Miura M. Iwatsubo T. Neurosci. Lett. 2003; 336: 155-158Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar, 12Hasegawa M. Fujiwara H. Nonaka T. Wakabayashi K. Takahashi H. Lee V.M. Trojanowski J.Q. Mann D. Iwatsubo T. J. Biol. Chem. 2002; 277: 49071-49076Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (345) Google Scholar) is phosphorylated at Ser-129 (Ser(P)-129). Proteinaceous inclusions formed in cellular and animal models overexpressing WT or mutant α-syn can also be stained with an antibody against Ser(P)-129. A study by Fujiwara et al. (8Fujiwara H. Hasegawa M. Dohmae N. Kawashima A. Masliah E. Goldberg M.S. Shen J. Takio K. Iwatsubo T. Nat. Cell Biol. 2002; 4: 160-164Crossref PubMed Scopus (159) Google Scholar) reported that in vitro phosphorylated α-syn (at Ser-129, using casein kinase II (CK2)) forms fibrils more readily than unmodified α-syn. Phosphorylation at Ser-129 was also reported to promote the formation of cytoplasmic inclusions in some cell culture models of synucleinopathies (13Smith W.W. Margolis R.L. Li X. Troncoso J.C. Lee M.K. Dawson V.L. Dawson T.M. Iwatsubo T. Ross C.A. J. Neurosci. 2005; 25: 5544-5552Crossref PubMed Scopus (211) Google Scholar). Together, these findings suggested that phosphorylation at Ser-129 plays an important role in modulating α-syn aggregation, LB formation, and toxicity in vivo. However, in vivo studies by Feany and co-worker (7Chen L. Feany M.B. Nat. Neurosci. 2005; 8: 657-663Crossref PubMed Scopus (525) Google Scholar) suggest a lack of correlation between phosphorylation at Ser-129 and the level of α-synfibrillation. Overexpression of the phosphomimic S129D or coexpression of WT α-syn and G protein-coupled receptor kinase 2 (Gprk2), which phosphorylates α-syn specifically at Ser-129, in the Drosophila model of PD results in increased α-syn toxicity without an increase in the number of α-syn inclusions (compared with overexpression of WT α-syn). Interestingly, overexpression of S129A results in a significant increase (4×) in the number of inclusions and suppression of dopaminergic neuronal loss produced by expression of WT human α-syn. We considered that a rigorous examination and comparison of the biochemical and biophysical properties of phosphorylation mimicking mutants (S129A and S129E/D), and WT α-syn may clarify the observations described above as well as the molecular mechanisms by which phosphorylation at Ser-129 may modulate α-syn aggregation and toxicity in vivo. In addition to the phosphorylation mimics, we prepared, purified, and characterized the in vitro phosphorylated Ser(P)-129 form of α-syn. To better understand the role of the phosphate group in modulating α-syn aggregation and membrane binding properties, we compared the structural, oligomerization, fibrillation, and membrane binding properties of WT α-syn to those of the phosphorylation mimics (S129E, S129D) as well as the purified in vitro phosphorylated form of α-syn using NMR, circular dichroism (CD), size exclusion chromatography (SEC), SDS-PAGE, thioflavin T (ThT), and transmission electron microscopy (TEM). Together our results demonstrate that phosphorylation at Ser-129 inhibits rather than promotes α-syn fibril formation in vitro. Equally important is our finding that the phosphorylation mimics (S129E/D) do not reproduce the effect of phosphorylation at this site on α-syn structure and aggregation properties in vitro. These findings have significant implications for modeling synulceinopathies in vivo and our understanding of the role of α-syn in the pathogenesis of PD and related disorders. Cloning, Expression, and Purification of α-Syn Variants—The S129E, S129D, S129A, and S87A α-syn mutants were generated using site-directed mutagenesis employing complementary internal mutagenic primers and two-step PCR. All constructed sequences were confirmed by DNA sequencing. All proteins used in these studies were expressed as previously described (14Kessler J.C. Rochet J.C. Lansbury Jr., P.T. Biochemistry. 2003; 42: 672-678Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar). For the NMR studies, expression and purification of unlabeled and 15N-labeled α-syn were performed as described previously (15Bussell Jr., R. Eliezer D. J. Biol. Chem. 2001; 276: 45996-46003Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (235) Google Scholar, 16Hoyer W. Antony T. Cherny D. Heim G. Jovin T.M. Subramaniam V. J. Mol. Biol. 2002; 322: 383-393Crossref PubMed Scopus (419) Google Scholar). To enable attachment of a spin label, a single cysteine was introduced into α-syn at position 18 (A18C). The nitroxide spin label chosen for reaction with the cysteine-containing mutant was 1-oxy-2, 2, 5, 5-tetramethyl-d-pyrroline-3-methyl)-methanethiosulfonate (MTSL, Toronto Research Chemicals, Toronto, Ontario, Canada). MTSL has already been shown to efficiently react with α-syn cysteine mutants, and the reaction was carried out as described previously (17Bertoncini C.W. Jung Y.S. Fernandez C.O. Hoyer W. Griesinger C. Jovin T.M. Zweckstetter M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 1430-1435Crossref PubMed Scopus (630) Google Scholar). In Vitro Phosphorylation of Recombinant α-Syn—WT or mutant α-syn was phosphorylated by CK1 (New England Biolabs) at a concentration of 1.44 mg/ml (100 μm) unless otherwise stated. The reaction was carried out in the presence of 1.09 mm ATP (Sigma), 1× reaction solution supplied with the enzyme, and 1200 units of CK1/145 μg of α-syn. The phosphorylation reaction was incubated at 30 °C for the stated time points, and the reaction was stopped with EDTA disodium salt (5 mm final concentration) (Axon Lab). The progress of the reaction was monitored by reverse phase HPLC and mass spectrometry. Fibrillation Studies—To probe the effect of CK1 phosphorylation on the aggregation of α-syn, WT α-syn was phosphorylated for 24 h at 30 °C, and the reaction was stopped with EDTA disodium salt before the samples were subjected to fibrillation conditions at 37 °C with continuous shaking for the indicated time points. The unphosphorylated controls were subjected to the same conditions, but CK1 was not added. For fibrillation studies the proteins were dissolved in 20 mm Bis-Tris propane (Aldrich), 100 mm lithium chloride (Aldrich), pH 7.4, at a concentration of 70 μm, and fibril formation was monitored by ThT using an Analyst Fluorescence instrument (LJL Biosystems) as described previously (18Lashuel H.A. Petre B.M. Wall J. Simon M. Nowak R.J. Walz T. Lansbury Jr., P.T. J. Mol. Biol. 2002; 322: 1089-1102Crossref PubMed Scopus (688) Google Scholar). Sedimentation and Gel-filtration Separation of Monomeric α-Syn from Fibrillar Material—The degree of α-syn oligomerization was measured by determining the amount of soluble monomeric and oligomeric α-syn in solution at the indicated time points during the aggregation process. 75-μl aliquots withdrawn at the indicated time points from a main α-syn sample incubating at 37 °C were centrifuged at 18,000 × g for 30 min at 4 °C to remove any fibrils. The supernatant was then separated from the pelleted fibrils, and 30 μl were injected on an analytical Waters 2795 system equipped with a Waters 996 photodiode array detector and using an analytic Superdex 200 PC 3.2/30 column (Amersham Biosciences). The supernatant was also run on SDS-PAGE gels and stained with Coomassie Blue staining to verify the stability of the protein (see below). Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and Immunoblotting—α-Syn samples were diluted in loading buffer and separated on 12% SDS 1-mm gels. Gels were stained with Simply Blue safe stain (Invitrogen) or silver staining (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. For dot blot analysis, the proteins were deposited onto nitrocellulose membrane (Omnilab SA), and the membrane was blocked with Odyssey blocking buffer (Li-COR Biosciences GmbH) diluted 1:3 in PBS (Sigma) for 1 h at room temperature. The membrane was probed with the primary antibody (mouse monoclonal anti-α-syn (121-125) (211) at a dilution of 1:500 (Santa Cruz Biotechnology) or mouse anti-α-syn (15-123) at a dilution of 1:1000 (BD Transduction) or mouse monoclonal anti-phosphorylated α-syn Ser-129 at a dilution of 1:5000 (Wako) or rabbit polyclonal anti-phosphorylated α-syn Ser-87 at a dilution of 1:100) at room temperature for 1-2 h. After 4 PBST (PBS, 0.01% (v/v) Tween 20 (Fluka)) washes, the membrane was incubated with the secondary antibody (i.e. goat anti-mouse ALEXA Fluor 680) protected from light at room temperature for 1 h. The immunoblot was finally washed 4 times with PBST and 3 times with PBS and scanned in a Li-COR scanner at a wavelength of 700 nm. TEM—For TEM studies, WT or mutant α-syn samples were deposited on Formvar-coated 200 mesh copper grids (Electron Microscopy Sciences) at a concentration of 25 μm. Grids were washed with 2 drops of water and stained with 2 drops of freshly prepared 0.75% (w/v) uranyl acetate (Electron Microscopy Sciences). Specimens were inspected on a Philip CIME 12 electron microscope, operated at 80 kV. Digitized photographs were recorded with a slow scan CCD camera (Gatan, Model 679). Reverse Phase HPLC—Monitoring the phosphorylation reaction and purification of the various phosphorylated species of α-syn (i.e. monophosphorylated or diphosphorylated α-syn) was accomplished using reverse phase HPLC on a Waters 2795 instrument equipped with a Waters 996 photodiode array detector and using an analytical (4.6-mm inner diameter) or semi-preparative (10-mm inner diameter) C4 or C18-RP column (Vydac). A 35-50% linear gradient over (flow rate = 1 ml/min) (0.09% (v/v) trifluoroacetic acid (solution A), 90% (v/v) acetonitrile aqueous solution (solution B)) was applied, and the signal was monitored at 214 nm. In the case of the semi-preparative reverse phase HPLC, a 40-60% linear gradient over (flow rate = 5 ml/min) solution A, solution B was applied. Preparation of Large Unilamellar Vesicles and Small Unilamellar Vesicles and α-Syn-Liposome Complexes—1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (sodium salt) (POPG) (Avanti Polar Lipids Inc.) was purchased in chloroform which was removed by evaporation and lyophilization. The residual phospholipid was hydrated with 50 mm HEPES (Fluka), 150 mm NaCl (Fluka), pH 7.4, solution, giving rise to a phospholipid suspension of 10 mg/ml. To increase the efficiency of large unilamellar vesicles formation, 10 cycles of freezing in dry ice and thawing at 37 °C water bath were carried out. Small unilamellar vesicles were prepared by extrusion through a 100-nm polycarbonate membrane (Avestin Inc.) according to the manufacturer's instructions. The small unilamellar vesicles were stored at 4 °C and used within 3-5 days. The appropriate amount and volume of α-syn in PBS or sodium phosphate, pH 7.5, was mixed with the appropriate volume of POPG to generate a mass ratio of α-syn:POPG of 1:20. The α-syn-liposome complex was incubated for 2 h at room temperature before CD spectroscopy. Circular Dichroism—The average secondary structure of monomeric α-syn was determined by CD spectroscopy using a Jasco 810 Spectrometer. The Far UV-CD spectra (190-250 nm, integration time of 2 s for 0.2 nm) were collected at room temperature in a 1-mm path length quartz cuvette containing 0.1 mg/ml of α-syn in PBS or sodium phosphate buffer. Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-of-flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry—For two layer sample preparation, MALDI matrices and calibrants were from Sigma/Fluka (Schnelldorf, Germany), trifluoroacetic acid was from Pierce, and sinapinic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid were from Fluka. Cytochrome c and apomyoglobin were from Sigma. 2-μl aliquots of each collected peaks were reserved for the MALDI analysis. A two-layer sample preparation was selected for the molecular weight analysis. Two matrix solutions were prepared; a saturated solution of sinapinic acid in methanol (matrix solution 1) and a 14 mg/ml sinapinic acid solution in 0.1% trifluoroacetic acid, acetonitrile (1/1) (matrix solution 2). A thin matrix layer was first generated on the mirror-polished target using a gel loader tip with matrix solution 1. 1 μl of sample was mixed with 1 μl of sinapinic acid matrix solution, and 0.8 μl of this mixture was deposited on top of the thin layer and allowed to air dry. Samples were deposited twice and analyzed with a 4700 MALDI-TOF/TOF instrument (Applied Biosystems). 8000 laser shots were typically summed by random sampling of the surface to generate the spectra that were calibrated externally on the pseudomolecular peak of cytochrome c, and apomyoglobin was prepared with the same matrix and deposited close to the samples. NMR—NMR samples of free α-syn contained ∼0.1 mm 15N-labeled WT or mutant α-syn in 90% H2O, 10% D2O, 50 mm phosphate buffer at pH 7.4, 100 mm NaCl. NMR experiments were acquired on Bruker Avance 600 and 700 MHz NMR spectrometers. The temperature was set to 15 °C. At higher temperatures, NMR resonances particularly in the N-terminal domain were broadened. NMR data were processed and analyzed using NMRPipe (19Delaglio F. Grzesiek S. Vuister G.W. Zhu G. Pfeifer J. Bax A. J. Biomol. NMR. 1995; 6: 277-293Crossref PubMed Scopus (11570) Google Scholar) and Sparky 3 (T. D. Goddard and D. G. Kneller, SPARKY 3, University of California, San Francisco) and NMR-View (20Johnson B.A. Blevins R.A. J. Biomol. NMR. 1994; 4: 603-614Crossref PubMed Scopus (2678) Google Scholar). Spectra were referenced indirectly to sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate and ammonia using the known chemical shift of water. Tentative assignments for the spectra of mutant and phosphorylated proteins were obtained by transferring each previously assigned cross-peak in the 1H,15N heteronuclear single quantum coherence (HSQC) spectrum of the WT protein to the nearest unassigned cross-peak in each new spectrum. Subsequently, they were verified by three-dimensional HNHA and three-dimensional NOE-HSQC spectra. Normalized weighted average chemical shift differences for amide 1H and 15N chemical shifts were calculated according to Δav = [(Δδ2HN +Δδ2N/25)/2]1/2. 3J(HN,Hα) scalar couplings were measured in WT α-syn, phosphorylated S87A α-syn, and S129D α-syn using intensity modulated HSQC experiments. Pulse field gradient NMR experiments were acquired on unlabeled WT and mutant α-syn (200 μm) dissolved in 99.9% D2O, 50 mm phosphate buffer, pH 7.4, and containing dioxane (∼20 mm) as an internal radius standard and viscosity probe (21Wilkins D.K. Grimshaw S.B. Receveur V. Dobson C.M. Jones J.A. Smith L.J. Biochemistry. 1999; 38: 16424-16431Crossref PubMed Scopus (826) Google Scholar). Twenty one-dimensional 1H spectra were collected as a function of gradient amplitude employing the PG-SLED sequence (21Wilkins D.K. Grimshaw S.B. Receveur V. Dobson C.M. Jones J.A. Smith L.J. Biochemistry. 1999; 38: 16424-16431Crossref PubMed Scopus (826) Google Scholar, 22Jones J.A. Wilkins D.K. Smith L.J. Dobson C.M. J. Biomol. NMR. 1997; 10: 199-203Crossref Scopus (205) Google Scholar). Each experiment was repeated at least twice. The gradient strength was increased from 1.69 to 33.72 Gauss/cm in a linear manner. Each 1H spectrum comprised 32 scans plus 16 steady-state scans. 16,000 complex points were acquired with a spectral width of 6000 Hz. Signals corresponding to the aliphatic region of the 1H spectra (3.3-0.5 ppm) were integrated, and diffusion data (signal intensity versus gradient strength) were fitted to Gaussian functions using XWINNMR (Bruker Instruments, Karlsruhe, Germany). Stokes radii of α-syn were calculated from the apparent diffusion coefficients of α-syn and dioxane and the known Stokes radius of dioxane (22Jones J.A. Wilkins D.K. Smith L.J. Dobson C.M. J. Biomol. NMR. 1997; 10: 199-203Crossref Scopus (205) Google Scholar). Errors in stokes radii estimated from repeat measurements are about 0.3 Å. For WT and phosphorylated S87A α-syn, paramagnetic relaxation enhancement profiles were derived from the measurement of peak intensity ratios between two 1H,15N HSQC spectra in the presence (Ipar) and absence (Idia) of the nitroxide radical. NMR for SDS Micelle-bound α-Syn—NMR experiments on SDS micelle-bound α-syn were performed on samples containing 120 μm α-syn. Lyophilized S87A, either unphosphorylated or phosphorylated, was dissolved in sample buffer (100 mm NaCl, 10 mm Na2HPO4, pH 7.4, in 90%, 10% H2O, D2O) with 40 mm SDS. Two-dimensional 1H,15N HSQC spectra were recorded on a Varian INOVA spectrometer operating at a 1H resonance frequency of 600MHz and a sample temperature of 40 °C for all samples. Generation of Ser(P)-129 and the Phosphomimics S129E/D—The structural and electrostatic similarities between Glu/Asp and phospho-Ser suggest that this type of substitution represents a reasonable approach to mimic constitutive phosphorylation at a specific Ser residue (Fig. 1A). The phosphate moiety at pH 7 exists predominately in the fully deprotonated state, resulting in a net charge of -2, in contrast to the single negative charge contributed by Glu/Asp. To determine whether a substitution of Ser-129 by an acidic residue is sufficient to mimic the effect of phosphorylation, we prepared mutants in which Ser-129 was replaced by Glu (S129E) or Asp (S129D). To provide mechanistic insight into the in vivo studies performed with the phosphorylation mimics, the S129A variant was also prepared. The S129E, S129D, and S129A mutations were introduced within the human cDNA sequence of SNCA by two-step PCR mutagenesis, and the mutant proteins were expressed in Escherichia coli and purified to greater than 95% homogeneity, as verified by SDS-PAGE and mass spectrometry. To determine whether mutation of Ser-129 into a charged residue is sufficient to reproduce the effect of phosphorylation on the structural and aggregation properties of α-syn in vitro, we prepared the Ser(P)-129 α-syn using CK1. We found that CK1 phosphorylates α-syn more efficiently than casein kinase II (supplemental Fig. 2). To block CK1-mediated phosphorylation at Ser-87, the S87A mutant of α-syn was expressed, purified, and phosphorylated in vitro to generate S87A/Ser(P)-129 α-syn (supplemental Fig. 3). To verify that phosphorylation by CK1 occurs at Ser-129, we made use of the anti-phospho-Ser-129 antibody (supplemental Fig. 4). Ser(P)-129 can be detected as early as the first 3 h of incubation (data not shown) and increases with time and increasing CK1 concentration. α-Syn Is Disordered Independent of Phosphorylation—To elucidate the consequences of phosphorylation on the structure and dynamics of monomeric α-syn, we performed a series of CD measurements and high resolution NMR studies. NMR resonances in 1H,15N HSQC spectra of WT and S87A α-syn, unphosphorylated and phosphorylated, were recorded at 15 °C. For all proteins, the resonances were sharp and showed only a limited dispersion of chemical shifts, reflecting a high degree of backbone mobility (Fig. 1). Chemical shifts in WT and S87A α-syn in the unphosphorylated form were highly similar except in direct vicinity of the mutation site (supplemental Fig. 4). Upon phosphorylation of WT α-syn by CK1, the resonances of Ser-87 and Ser-129 were strongly attenuated at the position seen in the HSQC of the unphosphorylated protein. At the same time, new signals appeared in the region in which resonances of phosphorylated amino acids are usually found (Figs. 1, C and D, and supplemental Fig. 1). Three-dimensional NMR spectra assigned the new signals to Ser-87 and Ser-129. For S87A α-syn, phosphorylation at Ser-87 was blocked such that only the resonance of Ser-129 was attenuated at its original position and appeared at its phosphorylated position (Fig. 1D). Other chemical shift changes induced by phosphorylation were generally small. Detailed analysis, however, showed that the chemical shifts of residues down to residue 90 were influenced by phosphorylation of Ser-129 in S87A α-syn. In addition, weak chemical shift changes were observed for the 60 N-terminal residues (Fig. 2C) in S87A α-syn, in agreement with recent studies (23Sasakawa H. Sakata E. Yamaguchi Y. Masuda M. Mori T. Kurimoto E. Iguchi T. Hisanaga S.I. Iwatsubo T. Hasegawa M. Kato K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 363: 795-799Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). 3J(HN,Hα) scalar couplings are highly sensitive to the dihedral angles of the protein backbone. We measured 3J(HN,Hα) couplings in WT α-syn and phosphorylated S87A α-syn. 3J(HN,Hα) couplings were mostly close to their random coil values and were very similar for unphosphorylated WT and phosphorylated Ser-87α-syn (data not shown), indicating that phosphorylation has no apparent effect on the secondary structure of α-syn. Far UV-CD spectra of unphosphorylated WT, S129E, S129D, S129A, and S87A α-syn and phosphorylated WT and S87A α-syn were virtually identical and consistent with a predominantly random coil structure (Figs. 1B and 3). Phosphorylation Expands the Ensemble of Conformations Populated by α-Syn—Pulse field gradient NMR experiments allow accurate determination of the diffusion coefficient of a molecule. From the diffusion coefficient, a hydrodynamic radius Rh can be calculated that provides an estimation of the overall dimensions of a biomolecule. For WT α-syn, we determined a hydrodynamic radius of 28.2 Å (Fig. 2A). Upon the addition of 8 m urea, it increased to 36.4 Å. For S87A α-syn, the corresponding values were 28.1 and 36.2 Å, respectively. If α-syn were a true random coil, a hydrodynamic radius of 36.9 Å would be expected. When WT α-syn was phosphorylated, its hydrodynamic radius increased by 7.1 to 35.3 Å (Fig. 2A). Similarly, phosphorylation of S87A α-syn at Ser-129 increased Rh by 6.6 to 34.7 Å (Fig. 2A). The addition of 8 m urea to phosphorylated S87A α-syn only slightly further increased the Rh value to 35.6 Å, indicating that phosphorylation extends the ensemble of conformations populated by α-syn close to its fully random coil-like dimensions. Phosphorylation Disrupts Transient Intramolecular Long-range Interactions—To probe the effect of phosphorylation on transient long-range interactions, we measured paramagnetic relaxation enhancement of NMR resonances. The interactions between a specifically attached paramagnetic nitroxide radical and nearby (less than ∼25 Å) protons cause broadening of their NMR signals because of an increase in transverse relaxation rate (24Gillespie J.R. Shortle D. J. Mol. Biol. 1997; 268: 158-169Crossref PubMed Scopus (273) Google Scholar). This effect has an r-6 dependence on the electron-proton distance and, thus, allows the measurement of long-range distances between the spin label and the affected amide protons in proteins (25Kosen P.A. Scheek R.M. Naderi H. Basus V.J. Manogaran S. Schmidt P.G. Oppenheimer N.J. Kuntz I.D. Biochemistry. 1986; 25: 2356-2364Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar). Because the primary sequence of α-syn lacks cysteine, Ala-18 was mutated into a cysteine to provide an attachment point for the nitroxide radical MTSL. Neither the mere introduction of the mutation nor the addition of the MTSL radical modified the hydrodynamic radius or altered the time course of aggregation for α-syn (17Bertoncini C.W. Jung Y.S. Fernandez C.O. Hoyer W. Griesinger C. Jovin T.M. Zweckstetter M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 1430-1435Crossref PubMed Scopus (630) Google Scholar). Fig. 2B compares the paramagnetic relaxation enhancement profile observed for unphosphorylated WT and phosphorylated S87A α-syn. In unphosphorylated WT α-syn, the profile of

Increasing evidence suggests that phosphorylation may play an important role in the oligomerization, fibrillogenesis, Lewy body (LB) formation, and neurotoxicity of α-synuclein (α-syn) in Parkinson disease. Herein we demonstrate that α-syn is phosphorylated at S87 in vivo and within LBs. The levels of S87-P are increased in brains of transgenic (TG) models of synucleinopathies and human brains from Alzheimer disease (AD), LB disease (LBD), and multiple system atrophy (MSA) patients. Using antibodies against phosphorylated α-syn (S129-P and S87-P), a significant amount of immunoreactivity was detected in the membrane in the LBD, MSA, and AD cases but not in normal controls. In brain homogenates from diseased human brains and TG animals, the majority of S87-P α-syn was detected in the membrane fractions. A battery of biophysical methods were used to dissect the effect of S87 phosphorylation on the structure, aggregation, and membrane-binding properties of monomeric α-syn. These studies demonstrated that phosphorylation at S87 expands the structure of α-syn, increases its conformational flexibility, and blocks its fibrillization in vitro . Furthermore, phosphorylation at S87, but not S129, results in significant reduction of α-syn binding to membranes. Together, our findings provide novel mechanistic insight into the role of phosphorylation at S87 and S129 in the pathogenesis of synucleinopathies and potential roles of phosphorylation in α-syn normal biology.

Amyloid-β (Aβ) peptides play a key role in the pathogenesis of Alzheimer's disease and exert various toxic effects on neurons; however, relatively little is known about their influence on glial cells. Astrocytes play a pivotal role in brain homeostasis, contributing to the regulation of local energy metabolism and oxidative stress defense, two aspects of importance for neuronal viability and function. In the present study, we explored the effects of Aβ peptides on glucose metabolism in cultured astrocytes. Following Aβ 25-35 exposure, we observed an increase in glucose uptake and its various metabolic fates, i.e., glycolysis (coupled to lactate release), tricarboxylic acid cycle, pentose phosphate pathway, and incorporation into glycogen. Aβ increased hydrogen peroxide production as well as glutathione release into the extracellular space without affecting intracellular glutathione content. A causal link between the effects of Aβ on glucose metabolism and its aggregation and internalization into astrocytes through binding to members of the class A scavenger receptor family could be demonstrated. Using astrocyte-neuron cocultures, we observed that the overall modifications of astrocyte metabolism induced by Aβ impair neuronal viability. The effects of the Aβ 25-35 fragment were reproduced by Aβ 1-42 but not by Aβ 1-40 . Finally, the phosphoinositide 3-kinase (PI3-kinase) pathway appears to be crucial in these events since both the changes in glucose utilization and the decrease in neuronal viability are prevented by LY294002, a PI3-kinase inhibitor. This set of observations indicates that Aβ aggregation and internalization into astrocytes profoundly alter their metabolic phenotype with deleterious consequences for neuronal viability.

Abstract A multitude of biological processes are enabled by complex interactions between lipid membranes and proteins. To understand such dynamic processes, it is crucial to differentiate the constituent biomolecular species and track their individual time evolution without invasive labels. Here, we present a label-free mid-infrared biosensor capable of distinguishing multiple analytes in heterogeneous biological samples with high sensitivity. Our technology leverages a multi-resonant metasurface to simultaneously enhance the different vibrational fingerprints of multiple biomolecules. By providing up to 1000-fold near-field intensity enhancement over both amide and methylene bands, our sensor resolves the interactions of lipid membranes with different polypeptides in real time. Significantly, we demonstrate that our label-free chemically specific sensor can analyze peptide-induced neurotransmitter cargo release from synaptic vesicle mimics. Our sensor opens up exciting possibilities for gaining new insights into biological processes such as signaling or transport in basic research as well as provides a valuable toolkit for bioanalytical and pharmaceutical applications.

A novel mutation in the α-Synuclein (α-Syn) gene "G51D" was recently identified in two familial cases exhibiting features of Parkinson's disease (PD) and multiple system atrophy (MSA). In this study, we explored the impact of this novel mutation on the aggregation, cellular and biophysical properties of α-Syn, in an attempt to unravel how this mutant contributes to PD/MSA. Our results show that the G51D mutation significantly attenuates α-Syn aggregation in vitro. Moreover, it disrupts local helix formation in the presence of SDS, decreases binding to lipid vesicles C-terminal to the site of mutation and severely inhibits helical folding in the presence of acidic vesicles. When expressed in yeast, α-SynG51D behaves similarly to α-SynA30P, as both exhibit impaired membrane association, form few inclusions and are non-toxic. In contrast, enhanced secreted and nuclear levels of the G51D mutant were observed in mammalian cells, as well as in primary neurons, where α-SynG51D was enriched in the nuclear compartment, was hyper-phosphorylated at S129 and exacerbated α-Syn-induced mitochondrial fragmentation. Finally, post-mortem human brain tissues of α-SynG51D cases were examined, and revealed only partial colocalization with nuclear membrane markers, probably due to post-mortem tissue delay and fixation. These findings suggest that the PD-linked mutations may cause neurodegeneration via different mechanisms, some of which may be independent of α-Syn aggregation.