Although multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry holds considerable promise for quantifying candidate protein biomarkers in blood, transferability of MRM assays between laboratories has never been shown. Addona et al. assess the reproducibility, dynamic range and limits of detection and quantification of MRM across multiple sites. Verification of candidate biomarkers relies upon specific, quantitative assays optimized for selective detection of target proteins, and is increasingly viewed as a critical step in the discovery pipeline that bridges unbiased biomarker discovery to preclinical validation. Although individual laboratories have demonstrated that multiple reaction monitoring (MRM) coupled with isotope dilution mass spectrometry can quantify candidate protein biomarkers in plasma, reproducibility and transferability of these assays between laboratories have not been demonstrated. We describe a multilaboratory study to assess reproducibility, recovery, linear dynamic range and limits of detection and quantification of multiplexed, MRM-based assays, conducted by NCI-CPTAC. Using common materials and standardized protocols, we demonstrate that these assays can be highly reproducible within and across laboratories and instrument platforms, and are sensitive to low μg/ml protein concentrations in unfractionated plasma. We provide data and benchmarks against which individual laboratories can compare their performance and evaluate new technologies for biomarker verification in plasma.

Biomarker discovery produces lists of candidate markers whose presence and level must be subsequently verified in serum or plasma. Verification represents a paradigm shift from unbiased discovery approaches to targeted, hypothesis-driven methods and relies upon specific, quantitative assays optimized for the selective detection of target proteins. Many protein biomarkers of clinical currency are present at or below the nanogram/milliliter range in plasma and have been inaccessible to date by MS-based methods. Using multiple reaction monitoring coupled with stable isotope dilution mass spectrometry, we describe here the development of quantitative, multiplexed assays for six proteins in plasma that achieve limits of quantitation in the 1-10 ng/ml range with percent coefficients of variation from 3 to 15% without immunoaffinity enrichment of either proteins or peptides. Sample processing methods with sufficient throughput, recovery, and reproducibility to enable robust detection and quantitation of candidate biomarker proteins were developed and optimized by addition of exogenous proteins to immunoaffinity depleted plasma from a healthy donor. Quantitative multiple reaction monitoring assays were designed and optimized for signature peptides derived from the test proteins. Based upon calibration curves using known concentrations of spiked protein in plasma, we determined that each target protein had at least one signature peptide with a limit of quantitation in the 1-10 ng/ml range and linearity typically over 2 orders of magnitude in the measurement range of interest. Limits of detection were frequently in the high picogram/milliliter range. These levels of assay performance represent up to a 1000-fold improvement compared with direct analysis of proteins in plasma by MS and were achieved by simple, robust sample processing involving abundant protein depletion and minimal fractionation by strong cation exchange chromatography at the peptide level prior to LC-multiple reaction monitoring/MS. The methods presented here provide a solid basis for developing quantitative MS-based assays of low level proteins in blood.

Adoption of targeted mass spectrometry (MS) approaches such as multiple reaction monitoring (MRM) to study biological and biomedical questions is well underway in the proteomics community. Successful application depends on the ability to generate reliable assays that uniquely and confidently identify target peptides in a sample. Unfortunately, there is a wide range of criteria being applied to say that an assay has been successfully developed. There is no consensus on what criteria are acceptable and little understanding of the impact of variable criteria on the quality of the results generated. Publications describing targeted MS assays for peptides frequently do not contain sufficient information for readers to establish confidence that the tests work as intended or to be able to apply the tests described in their own labs. Guidance must be developed so that targeted MS assays with established performance can be made widely distributed and applied by many labs worldwide. To begin to address the problems and their solutions, a workshop was held at the National Institutes of Health with representatives from the multiple communities developing and employing targeted MS assays. Participants discussed the analytical goals of their experiments and the experimental evidence needed to establish that the assays they develop work as intended and are achieving the required levels of performance. Using this “fit-for-purpose” approach, the group defined three tiers of assays distinguished by their performance and extent of analytical characterization. Computational and statistical tools useful for the analysis of targeted MS results were described. Participants also detailed the information that authors need to provide in their manuscripts to enable reviewers and readers to clearly understand what procedures were performed and to evaluate the reliability of the peptide or protein quantification measurements reported. This paper presents a summary of the meeting and recommendations. Adoption of targeted mass spectrometry (MS) approaches such as multiple reaction monitoring (MRM) to study biological and biomedical questions is well underway in the proteomics community. Successful application depends on the ability to generate reliable assays that uniquely and confidently identify target peptides in a sample. Unfortunately, there is a wide range of criteria being applied to say that an assay has been successfully developed. There is no consensus on what criteria are acceptable and little understanding of the impact of variable criteria on the quality of the results generated. Publications describing targeted MS assays for peptides frequently do not contain sufficient information for readers to establish confidence that the tests work as intended or to be able to apply the tests described in their own labs. Guidance must be developed so that targeted MS assays with established performance can be made widely distributed and applied by many labs worldwide. To begin to address the problems and their solutions, a workshop was held at the National Institutes of Health with representatives from the multiple communities developing and employing targeted MS assays. Participants discussed the analytical goals of their experiments and the experimental evidence needed to establish that the assays they develop work as intended and are achieving the required levels of performance. Using this “fit-for-purpose” approach, the group defined three tiers of assays distinguished by their performance and extent of analytical characterization. Computational and statistical tools useful for the analysis of targeted MS results were described. Participants also detailed the information that authors need to provide in their manuscripts to enable reviewers and readers to clearly understand what procedures were performed and to evaluate the reliability of the peptide or protein quantification measurements reported. This paper presents a summary of the meeting and recommendations. Targeted mass spectrometry (MS) approaches have tremendous promise for specific, reproducible and quantitative measurement of changes in the levels of proteins, peptides, and modified peptides of interest to biologists and biomedical researchers (1Gillette M.A. Carr S.A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.Nat Methods. 2013; 10: 28-34Crossref PubMed Scopus (359) Google Scholar, 2Picotti P. Aebersold R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions.Nat. Methods. 2012; 9: 555-566Crossref PubMed Scopus (991) Google Scholar, 3Grebe S.K.G. Singh R.J.J. LC-MS/MS in the clinical laboratory—where to from here? Clin.Biochem. Rev. 2011; 32: 5-31Google Scholar and references therein). Adoption of targeted MS to study biological and clinical questions is well underway in the biomedical community with the assumption being that the measurements made using targeted MS methods are reliable, that is that they specifically identify and quantify the analytes targeted in a sample. In the field of proteomics, umbrella terms like “multiple reaction monitoring”, “selected reaction monitoring” (MRM 1The abbreviations used are:MRMmultiple reaction monitoringSRMselected reaction monitoringLODlimits of detectionLOQlimits of quantificationLLOQlower limits of quantification. 1The abbreviations used are:MRMmultiple reaction monitoringSRMselected reaction monitoringLODlimits of detectionLOQlimits of quantificationLLOQlower limits of quantification. and SRM, respectively; terms used interchangeably), “absolute quantification” and “targeted MS” can convey the erroneous message that the results are unquestionably correct with respect to what is being detected and how much is present. This is certainly not true, and is dependent on the extent to which the measurements have been analytically validated. multiple reaction monitoring selected reaction monitoring limits of detection limits of quantification lower limits of quantification. multiple reaction monitoring selected reaction monitoring limits of detection limits of quantification lower limits of quantification. The most widely used targeted MS approach at present is MRM (1Gillette M.A. Carr S.A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.Nat Methods. 2013; 10: 28-34Crossref PubMed Scopus (359) Google Scholar, 2Picotti P. Aebersold R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions.Nat. Methods. 2012; 9: 555-566Crossref PubMed Scopus (991) Google Scholar, 3Grebe S.K.G. Singh R.J.J. LC-MS/MS in the clinical laboratory—where to from here? Clin.Biochem. Rev. 2011; 32: 5-31Google Scholar). Unlike discovery proteomics experiments in which full-scan MS/MS spectra are collected, in MRM only three to five fragment ions per-precursor are monitored, typically on triple quadrupole MS systems, the most widely available MS instruments in clinical and drug metabolism laboratories. The fragment ions monitored are generally those that are most abundant rather than those that are most sequence informative; as a result there is little-to-no sequence information in MRM data. Furthermore, in complex matrices like plasma, tissue or cell lysates, peptides with the same or similar precursor mass-to-charge ratio (e.g. ±1.5 in m/z) to an analyte of interest can give rise to many and sometimes all of the three to five fragment ions monitored for a specific analyte, resulting in false positives. Therefore, it is essential that other information be used to increase confidence in assignment and quantification in targeted MS experiments. In contrast to the long and well developed history of MS-based assay development for small molecules, drugs and metabolites (3Grebe S.K.G. Singh R.J.J. LC-MS/MS in the clinical laboratory—where to from here? Clin.Biochem. Rev. 2011; 32: 5-31Google Scholar, 4Lawson A.M. The scope of mass spectrometry in clinical chemistry.Clin. Chem. 1975; 21: 803-824Crossref PubMed Scopus (48) Google Scholar, 5Parsons H.G. Stable isotopes in the management and diagnosis of inborn errors of metabolism.Can. J. Physiol. Pharmacol. 1990; 68: 950-954Crossref PubMed Scopus (3) Google Scholar, 6Brumley W.C. Sphon J.A. Regulatory mass spectrometry.Biomed. Mass Spectrom. 1981; 8: 390-396Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar, 7Sphon J.A. Use of mass spectrometry for confirmation of animal drug residues.J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1978; 61: 1247-1252PubMed Google Scholar, 8Vargo J.D. Determination of sulfonic acid degradates of chloroacetanilide and chloroacetamide herbicides in groundwater by LC/MS/MS.Anal. Chem. 1998; 70: 2699-2703Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 9Kuhara T. Noninvasive human metabolome analysis for differential diagnosis of inborn errors of metabolism.J. Chromatog. 2007; 855: 42-50Google Scholar, 10Pitt J.J. Eggington M. Kahler S.G. Comprehensive screening of urine samples from inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry.Clin. Chem. 2002; 48: 1970-1980Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar), consensus on what performance criteria are essential to define for peptide and protein assay development has yet to be achieved. This has led to a range of problems that continue to plague the development of reliable proteomic assays for both clinical and biological studies. For example, currently, a wide range of criteria are being applied in the proteomics community to assert that an assay has been successfully developed and that analytes of interest are being confidently detected and changes in their levels reliably quantified. Proteomics scientists are only slowly implementing practices in targeted, quantitative assay development that have been learned and adopted by the small molecule community (11Timmerman P. Anders Kall M. Gordon B. Laakso S. Freisleben A. Hucker R. Best practices in a tiered approach to metabolite quantification: Views and recommendations of the European Bioanalysis Forum.Bioanalysis. 2010; 2: 1185-1194Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar, 12Timmerman P. Herling C. Stoellner D. Jaitner B. Pihl S. Elsby K. Henderson N. Barroso B. Fischmann S. Companjen A. Versteilen A. Bates S. Kingsley C. Kunz U. European Bioanalysis Forum recommendation on method establishment and bioanalysis of biomarkers in support of drug development.Bioanalysis. 2012; 4: 1883-1894Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 13Timmerman P. Lausecker B. Barosso B. van Amsterdam P. Luedtke S. Dijksman J. ‘Large Meets Small’: connecting the bioanalytical community around peptide and protein bioanalysis with LC-MS(/MS).Bioanalysis. 2012; 4: 627-631Crossref PubMed Scopus (12) Google Scholar). Equally troubling is that targeted-MS papers are being published without clear and complete documentation of the analytical methods used or the assay performance, making it difficult if not impossible for reviewers and readers to have confidence that the tests work as intended to apply the tests described in their own labs with an expectation that similar results can be achieved. Therefore, we assert that strong, consensus guidance must be developed addressing quality assay development, if targeted proteomics is going to have the impact we all desire it to have, providing accurate, reliable assays of known performance metrics that can be widely distributed and applied by many labs worldwide. To begin to address the problems and their solutions, a workshop was held June 18 and 19, 2013 at the National Institutes of Health under the auspices of the National Cancer Institute (CPTAC - Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium) and National Heart, Lung, and Blood Institute (Proteomics Centers). Representatives from the multiple communities developing and employing targeted assays were present, including in vitro diagnostic companies, clinical laboratories, labs specializing in quantitative assay development for candidate biomarker verification and biology-focused labs. Investigators with long experience in the application of targeted MS methods for quantification of small molecules were invited to provide a review of the decades of practice and application of MRM in small molecule quantification, providing a foundation to principles that are equally applicable to the proteomic applications under discussion. Speakers and participants were asked to use a “fit-for-purpose” approach by identifying the analytical goals of their experiments and then to describe the performance characteristics required for success (14Thompson M. Ramsey M.H. Quality concepts and practices applies to sampling – an exploratory study.Analyst. 1995; 120: 261-270Crossref Scopus (89) Google Scholar, 15Bethem R. Boyd R.K. Mass spectrometry in trace analysis.J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 1998; 9: 643-648Crossref Scopus (28) Google Scholar, 16Bethem R. Boison J. Gale J. Heller D. Lehotay S. Loo J. Musser S. Price P. Stein S. Establishing the fitness for purpose of mass spectrometric methods.J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 2003; 14: 528-541Crossref PubMed Scopus (77) Google Scholar, 17Lee J.W. Devanarayan V. Barrett Y.C. Weiner R. Allinson J. Fountain S. Keller S. Weinryb I. Green M. Duan L. Rogers J.A. Millham R. O'Brien P.J. Sailstad J. Khan M. Ray C. Wagner J.A. Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement.Pharm. Res. 2006; 23: 312-328Crossref PubMed Scopus (612) Google Scholar, 18Lee J.W. Figeys D. Vasilescu J. Biomarker assay translation from discovery to clinical studies in cancer drug development: quantification of emerging protein biomarkers.Adv. Cancer Res. 2007; 96: 269-298Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 19Cummings J. Raynaud F. Jones L. Sugar R. Dive C. on behalf of the Bioanalysis and Quality Assurance (BAQA) Group of the ECMCFit-for-purpose biomarker method validation for application in clinical trials of anticancer drugs.Br. J. Cancer. 2010; 103: 1313-1317Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). Based on the goals of the measurements, we next sought to identify the experimental evidence (i.e. the “analytical validation” steps) needed to establish that the assays reported are working as intended and are achieving the required levels of performance (including the test's repeatability, reproducibility, limits of detection, analytical specificity, etc.). Computational and statistical tools useful for the analysis of targeted MS results, including generation of response/calibration curves, determination of limits of detection and quantification (LOD and LOQ, respectively), were discussed. This process led to the identification of three “Tiers” of assays/measurements that are described in detail, below. Participants were also asked to identify what information authors need to provide in their manuscripts to enable reviewers and readers to clearly understand what procedures were performed and to evaluate the reliability of the peptide or protein quantification measurements reported. We present a summary of those recommendations, below. As follow-on to the workshop and this report, Molecular and Cellular Proteomics intends to develop guidelines for authors of papers describing development and/or application of targeted MS methods. The need for establishing guidelines for authors parallels the situation in discovery proteomics before 2004 when similar issues relating to lack of ability to ascertain reliability of published results prompted the journal Molecular and Cellular Proteomics to develop and adopt the first set of guidelines for publication of peptide and protein identification data using mass spectrometry (20Carr S.A. Aebersold R. Baldwin M. Burlingame A. Clauser K. Nesvizhski A. The need for guidelines in publication of peptide and protein identification data.Mol. Cell. Proteomics. 2004; 3: 531-533Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (412) Google Scholar). These guidelines, which have been repeatedly revised and updated over the past several years (21Bradshaw R.A. Burlingame A.L. Carr S. Aebersold R. Reporting protein identification data: the next generation of guidelines.Mol. Cell. Proteomics. 2006; 5: 787-788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (203) Google Scholar, 22Chalkley R.J. Clauser K.R. Carr S.A. Updating the MCP Proteomic publication guidelines.ASBMB Today. 2009; : 16-17Google Scholar, 23http://www.mcponline.org.libproxy.mit.edu/site/misc/PhialdelphiaGuidelinesFINALDRAFT.pdfGoogle Scholar), have been embraced in whole or in part by other proteomics journals. The goal then, as it is now, was to try to ensure that reliable, high quality data and results are entering the proteomics literature. The group identified three tiers of targeted MS assays/measurements based on the intended purpose of the measurements (“fit for purpose” concept) and then worked to define the extent of analytical validation required in each Tier (Table I). A list of speakers, presentations, and discussion groups is available in supplemental Materials.Table IThree Tiers of Targeted MS Measurements; experimental design parameters and assay characteristics are listed for each tier Andy Hoofnagle, University of Washington and Russell Grant, Laboratory Corporation of America led the discussion around Tier 1. The goals of developing and applying Tier 1 assays are to (1) provide accurate, precise, clinically actionable information for medical practitioners or (2) inform decision-making in the development of drugs for human use. In pharmaceutical applications the goals include quantifying proteins targeted by therapeutics, assessment of target engagement (free, complex, total) in preclinical and proof of concept studies, and measurement of mechanistic, protein biomarkers that are proximal to the target/site of action to examine pharmacodynamics. Depending on the use of the assay data, these tests may need to meet the requirements of the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (CLIA), the US Food and Drug Administration (FDA), or the European Medicines Agency (EMA) (for example, see 24Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. (2001) US Department of Health and Human Services, US FDA, Center for Drug Evaluation and Research, Rockville, MD, U.S.A. (Rev. 1, September, 2013)Google Scholar, 25Guideline on Bioanalytical Method Validation. EMA, Committee for Medicinal Products for Human Use, London, UK2011Google Scholar). Guidance from these agencies and accrediting organizations, as well as those from the Clinical and Laboratory Standards Institute (http://www.clsi.org) continues to evolve and be clarified, especially for newer approaches in protein analysis, like targeted MS. These changes and clarifications are driven, in part, through dialog and interaction among the pharmaceutical, diagnostic companies, and regulatory agencies all working to improve assay quality when it pertains, even indirectly, to the care of patients (for example, see 26DeSilvaWhite paper on recent issues in bioanalysis and alignment of multiple guidelines.Bioanalysis. 2012; 4: 2213-2226Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar). The goal is to provide complete, high-quality data for review for regulatory purposes. The use of stable isotope-labeled internal standards provides the highest level of detection confidence and measurement precision in targeted MS experiments (26DeSilvaWhite paper on recent issues in bioanalysis and alignment of multiple guidelines.Bioanalysis. 2012; 4: 2213-2226Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 27Barr J.R. Maggio V.L. Patterson Jr., D.G. Cooper G.R. Henderson L.O. Turner W.E. et al.Isotope dilution–mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I.Clin Chem. 1996; 42: 1676-1682Crossref PubMed Scopus (321) Google Scholar, 28Gerber S.A. Rush J. Stemman O. Kirschner M.W. Gygi S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.Proc. Nat. Acad. Sci. 2003; 100: 6940-6945Crossref PubMed Scopus (1542) Google Scholar, 29Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 2: 2212Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (576) Google Scholar, 30Berna M.J. Ott L. Engle S. Watson D. Solter P. Ackermann B. Quantification of NTproBNP in rat serum using immunoprecipitation and LC/MS/MS: a Biomarker of drug-induced cardiac hypertrophy.Anal. Chem. 2008; 80: 561-566Crossref PubMed Scopus (58) Google Scholar, 31Addona T.A. Abbatiello S.E. Schilling B. Skates S.J. Mani D.R. Bunk D.M. Spiegelman C.H. Zimmerman L.J. Ham A.J.L. Keshishian H. Hall S.C. Allen S. Blackman R.K. Borchers C.H. Buck C. Cardasis H.L. Cusack M.P. Dodder N.G. Gibson B.W. Held J.M. Hiltke T. Jackson A. Johansen E.B. Kinsinger C.R. Li J. Mesri M. Neubert T.A. Niles R.K. Pulsipher T.C. Ransohoff D. Rodriguez H. Rudnick P.A. Smith D. Tabb D.L. Tegeler T.J. Variyath A.M. Vega-Montoto L.J. Wahlander A. Waldemarson S. Wang M. Whiteaker J.R. Zhao L. Anderson N.L. Fisher S.J. Liebler D.C. Paulovich A.G. Regnier F.E. Tempst P. Carr S.A. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.Nat. Biotechnol. 2009; 27: 633-685Crossref PubMed Scopus (862) Google Scholar, 32Picotti P. Bodenmiller B. Mueller L.N. Domon B. Aebersold R. Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targeted proteomics.Cell. 2009; 138 (doi: 10.1016/j.cell.2009.05.051. Epub 2009 Aug 6): 795-806Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (647) Google Scholar, 33Whiteaker J.R. Zhao L. Abbatiello S.E. Burgess M. Kuhn E. Lin C.W. Pope M.E. Razavi M. Anderson N.L. Pearson T.W. Carr S.A. Paulovich A.G. Evaluation of large scale quantitative proteomic assay development using peptide affinity-based mass spectrometry.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M110.005645)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (119) Google Scholar, 34Shi T. Fillmore T.L. Sun X. Zhao R. Schepmoes A.A. Hossain M. Xie F. Wu S. Kim J.S. Jones N. Moore R.J. Pasa-Tolic L. Kagan J. Rodland K.D. Liu T. Tang K. Camp D.G. Smith R.D. Qian W.J. Antibody-free, targeted mass-spectrometric approach for quantification of proteins at low picogram per milliliter levels in human plasma/serum.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012; 109: 15395-15400Crossref PubMed Scopus (171) Google Scholar, 35Wang Q. Chaerkady R. Wu J. Hwang H.J. Papadopoulos N. Kopelovich L. Maitra. A. Matthaei H. Eshleman J.R. Hruban R.H. Kinzler K.W. Pandey A. Vogelstein B. Mutant proteins as cancer-specific biomarkers.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011; 108: 2444-2449Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar, 36Addona T.A. Shi X. Keshishian H. Mani D.R. Burgess M. Gillette M.A. Clauser K.R. Shen D. Lewis G.D. Farrell L.A. Fifer M.A. Sabatine M.S. Gerszten R.E. Carr S.A. A pipeline that integrates the discovery and verification of plasma protein biomarkers reveals candidate markers for cardiovascular disease.Nat. Biotechnol. 2011; 29: 635-643Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 37Whiteaker J.R. Lin C. Kennedy J. Hou L. Trute M. Sokal I. Yan P. Schoenherr R.M. Zhao L. Voytovich U.J. Kelly-Spratt K.S. Krasnoselsky A. Gafken P.R. Hogan J.M. Jones L.A. Wang P. Amon L. Chodosh L.A. Nelson P.S. McIntosh M.W. Kemp C.J. Paulovich A.G. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.Nat. Biotech. 2011; 29: 625-634Crossref PubMed Scopus (291) Google Scholar, 38Domanski D. Percy A.J. Yang J. Chambers A.G. Hill J.S. Freue G.V. Borchers C.H. MRM-based multiplexed quantitation of 67 putative cardiovascular disease biomarkers in human plasma.Proteomics. 2012; 12: 1222-1243Crossref PubMed Scopus (172) Google Scholar, 39Pan S. Chen R. Brand R.E.. Hawley S. Tamura Y. Gafken P.R. Milless B.P. Goodlett D.R. Rush J. Brentnall T.A. Multiplex targeted proteomic assay for biomarker detection in plasma: A pancreatic cancer biomarker case study.J. Proteome Res. 2012; 11: 1937-1948Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar, 40Huttenhain R. Soste M. Selevsek N. Rost H. Sethi A. Carapito C.. Farrah T. Deutsch E.W. Kusebauch U. Moritz R.L. Nimeus-Malmstrom E. Rinner O. Aebersold R. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.Sci. Transl. Med. 2012; 4: 1-13Crossref Scopus (208) Google Scholar, 41Kushnir M.M. Rockwood A.L. Roberts W.L. Abraham D. Hoofnagle A.N. Meikle A.W. Measurement of thyroglobulin by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in serum and plasma in the presence of antithyroglobulin autoantibodies.Clinical Chemistry. 2013; 59: 982-990Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 42Neubert H. Muirhead D. Kabir M. Grace C. Cleton A. Arends R. Sequential protein and peptide immunoaffinity capture for mass spectrometry-based quantification of total human beta-nerve growth factor.Anal. Chem. 2013; 85: 1719-1726Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar). This approach, adopted from the field of small molecule quantitative analysis, is known as Stable Isotope Dilution (43Rifai N. Gillette M.A. Carr S.A. Protein biomarker discovery and validation: the long and uncertain path to clinical utility.Nat. Biotechnol. 2006; 24: 971-983Crossref PubMed Scopus (1367) Google Scholar, 44Brun V. Masselon C. Garin J. Dupuis A. Isotope dilution strategies for absolute quantitative proteomics.J. Proteomics. 2009; 72: 740-749Crossref PubMed Scopus (262) Google Scholar). In Tier 1, best practice would dictate the use of stable isotope-labeled internal standards for each target analyte. Labeled analog proteins can also be used as internal standards if properly characterized and validated. Internal standards are ideally included to control for the fate of analytes through the analytical process, which enables more precise quantification. Assay precision can be strongly affected by variations in sample processing, especially by the enzymatic digestion conditions used (31Addona T.A. Abbatiello S.E. Schilling B. Skates S.J. Mani D.R. Bunk D.M. Spiegelman C.H. Zimmerman L.J. Ham A.J.L. Keshishian H. Hall S.C. Allen S. Blackman R.K. Borchers C.H. Buck C. Cardasis H.L. Cusack M.P. Dodder N.G. Gibson B.W. Held J.M. Hiltke T. Jackson A. Johansen E.B. Kinsinger C.R. Li J. Mesri M. Neubert T.A. Niles R.K. Pulsipher T.C. Ransohoff D. Rodriguez H. Rudnick P.A. Smith D. Tabb D.L. Tegeler T.J. Variyath A.M. Vega-Montoto L.J. Wahlander A. Waldemarson S. Wang M. Whiteaker J.R. Zhao L. Anderson N.L. Fisher S.J. Liebler D.C. Paulovich A.G. Regnier F.E. Tempst P. Carr S.A. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.Nat. Biotechnol. 2009; 27: 633-685Crossref PubMed Scopus (862) Google Scholar, 45Kuzyk M.A. Smith D. Yang J.C. Cross T.J. Jackson A.M. Hardie D.B. Anderson N.L. Borchers C.H. Multiple reaction monitoring-based, multiplexed, absolute quantitation of 45 proteins in human plasma.Mol. Cell. Proteomics. 2009; 8: 1860-1877Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (444) Google Scholar, 46Shuford C.M. Sederoff R.R. Chiang V.L. Muddiman D.C. Peptide production and decay rates affect the quantitative accuracy of protein cleavage isotope dilution mass spectrometry (PC-IDMS).Mol. Cell. Proteomics. 2012; 11: 814-823Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (61) Google Scholar). Good precision can only be obtained when these conditions are carried out reproducibly. Peptide concentrations are derived by measurement of the peak area ratios of one or more of the fragment ions from the labeled internal standard and the endogenous peptide. Stable isotope-labeled peptides provide this added measure of confidence as they (1) co-elute with the targeted analytes, (2) fragment to yield the corresponding, mass-shifted peptide backbone fragment ions, (3) have (in the absence of interference) identical relative abundances of the fragment ions as the endogenous peptide, and (4) compensate for ion suppression and poor spray stability (47Matuszewski B.K. Constanzer M.L. Chavez-Eng C.M. Matrix effect in quantitative LC/MS/MS analyses of biological fluids: a method for determination of finasteride in human plasma at picogram per milliliter concentrations.Anal. Chem. 1998; 70: 882-889Crossref PubMed Scopus (864) Google Scholar, 48King R. Bonfiglio R. Fernandez-Metzler C. Miller-Stein C. Olah T. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization.J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000; 11: 942-950Crossref PubMed Scopus (941) Google Scholar, 49Abbatiello S.E. Mani D.R. Keshishian H. Carr S.A. Automated Detection of inaccurate and imprecise transitions in quantitative assays of peptides by multiple monitoring mass spectrometry.Clin. Chem. 2010; 56: 291-305Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar, 50Reiter L. Rinner O. Picotti P. Hüttenhain R. Beck M. Brusniak M.Y. Hengartner M.O. Aebersold R. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments.Nat. Methods. 2011; 8: 430-435Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar, 51Keshishian H. Addona T. Burgess M. Mani D.R. Shi X. Kuhn E. Sabatine M.S. Gerszten R.E. Carr S.A. Quantification of cardiovascular biomarkers in patient plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2009; 8: 2339-2349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (254) Google Scholar). Ion suppression is an insidious problem caused by other matrix components (lipids and other small molecules, peptides, salts, etc.) that co-elute and compete with the analyte of interest for ionization. Ion suppression results in a decrease in the ion current detected for the same amount of analyte analyzed from different samples. Ideally, the internal standard has the same structure as the analyte and co-e

Here we present an optimized workflow for global proteome and phosphoproteome analysis of tissues or cell lines that uses isobaric tags (TMT (tandem mass tags)-10) for multiplexed analysis and relative quantification, and provides 3× higher throughput than iTRAQ (isobaric tags for absolute and relative quantification)-4-based methods with high intra- and inter-laboratory reproducibility. The workflow was systematically characterized and benchmarked across three independent laboratories using two distinct breast cancer subtypes from patient-derived xenograft models to enable assessment of proteome and phosphoproteome depth and quantitative reproducibility. Each plex consisted of ten samples, each being 300 μg of peptide derived from <50 mg of wet-weight tissue. Of the 10,000 proteins quantified per sample, we could distinguish 7,700 human proteins derived from tumor cells and 3100 mouse proteins derived from the surrounding stroma and blood. The maximum deviation across replicates and laboratories was <7%, and the inter-laboratory correlation for TMT ratio–based comparison of the two breast cancer subtypes was r > 0.88. The maximum deviation for the phosphoproteome coverage was <24% across laboratories, with an average of >37,000 quantified phosphosites per sample and differential quantification correlations of r > 0.72. The full procedure, including sample processing and data generation, can be completed within 10 d for ten tissue samples, and 100 samples can be analyzed in ~4 months using a single LC-MS/MS instrument. The high quality, depth, and reproducibility of the data obtained both within and across laboratories should enable new biological insights to be obtained from mass spectrometry-based proteomics analyses of cells and tissues together with proteogenomic data integration. This protocol describes a workflow for multiplexed deep-scale, quantitative proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissue samples. The procedure includes step-by-step instructions for all stages, from sample preparation to data analysis.

Prediction of HLA epitopes is important for the development of cancer immunotherapies and vaccines. However, current prediction algorithms have limited predictive power, in part because they were not trained on high-quality epitope datasets covering a broad range of HLA alleles. To enable prediction of endogenous HLA class I-associated peptides across a large fraction of the human population, we used mass spectrometry to profile >185,000 peptides eluted from 95 HLA-A, -B, -C and -G mono-allelic cell lines. We identified canonical peptide motifs per HLA allele, unique and shared binding submotifs across alleles and distinct motifs associated with different peptide lengths. By integrating these data with transcript abundance and peptide processing, we developed HLAthena, providing allele-and-length-specific and pan-allele-pan-length prediction models for endogenous peptide presentation. These models predicted endogenous HLA class I-associated ligands with 1.5-fold improvement in positive predictive value compared with existing tools and correctly identified >75% of HLA-bound peptides that were observed experimentally in 11 patient-derived tumor cell lines. Prediction of HLA class I epitopes is improved in accuracy and breath with peptidomes from 95 mono-allelic cell lines.

Blood cell formation is classically thought to occur through a hierarchical differentiation process, although recent studies have shown that lineage commitment may occur earlier in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). The relevance to human blood diseases and the underlying regulation of these refined models remain poorly understood. By studying a genetic blood disorder, Diamond-Blackfan anemia (DBA), where the majority of mutations affect ribosomal proteins and the erythroid lineage is selectively perturbed, we are able to gain mechanistic insight into how lineage commitment is programmed normally and disrupted in disease. We show that in DBA, the pool of available ribosomes is limited, while ribosome composition remains constant. Surprisingly, this global reduction in ribosome levels more profoundly alters translation of a select subset of transcripts. We show how the reduced translation of select transcripts in HSPCs can impair erythroid lineage commitment, illuminating a regulatory role for ribosome levels in cellular differentiation.

Verification of candidate biomarkers requires specific assays to selectively detect and quantify target proteins in accessible biofluids. The primary objective of verification is to screen potential biomarkers to ensure that only the highest quality candidates from the discovery phase are taken forward into preclinical validation. Because antibody reagents for a clinical grade immunoassay often exist for a small number of candidates, alternative methodologies are required to credential new and unproven candidates in a statistically viable number of serum or plasma samples. Using multiple reaction monitoring coupled with stable isotope dilution MS, we developed quantitative, multiplexed assays in plasma for six proteins of clinical relevance to cardiac injury. The process described does not require antibodies for immunoaffinity enrichment of either proteins or peptides. Limits of detection and quantitation for each signature peptide used as surrogates for the target proteins were determined by the method of standard addition using synthetic peptides and plasma from a healthy donor. Limits of quantitation ranged from 2 to 15 ng/ml for most of the target proteins. Quantitative measurements were obtained for one to two signature peptides derived from each target protein, including low abundance protein markers of cardiac injury in the nanogram/milliliter range such as the cardiac troponins. Intra- and interassay coefficients of variation were predominantly <10 and 25%, respectively. The configured multiplex assay was then used to measure levels of these proteins across three time points in six patients undergoing alcohol septal ablation for hypertrophic obstructive cardiomyopathy. These results are the first demonstration of a multiplexed, MS-based assay for detection and quantification of changes in concentration of proteins associated with cardiac injury in the low nanogram/milliliter range. Our results also demonstrate that these assays retain the necessary precision, reproducibility, and sensitivity to be applied to novel and uncharacterized candidate biomarkers for verification of proteins in blood. Verification of candidate biomarkers requires specific assays to selectively detect and quantify target proteins in accessible biofluids. The primary objective of verification is to screen potential biomarkers to ensure that only the highest quality candidates from the discovery phase are taken forward into preclinical validation. Because antibody reagents for a clinical grade immunoassay often exist for a small number of candidates, alternative methodologies are required to credential new and unproven candidates in a statistically viable number of serum or plasma samples. Using multiple reaction monitoring coupled with stable isotope dilution MS, we developed quantitative, multiplexed assays in plasma for six proteins of clinical relevance to cardiac injury. The process described does not require antibodies for immunoaffinity enrichment of either proteins or peptides. Limits of detection and quantitation for each signature peptide used as surrogates for the target proteins were determined by the method of standard addition using synthetic peptides and plasma from a healthy donor. Limits of quantitation ranged from 2 to 15 ng/ml for most of the target proteins. Quantitative measurements were obtained for one to two signature peptides derived from each target protein, including low abundance protein markers of cardiac injury in the nanogram/milliliter range such as the cardiac troponins. Intra- and interassay coefficients of variation were predominantly <10 and 25%, respectively. The configured multiplex assay was then used to measure levels of these proteins across three time points in six patients undergoing alcohol septal ablation for hypertrophic obstructive cardiomyopathy. These results are the first demonstration of a multiplexed, MS-based assay for detection and quantification of changes in concentration of proteins associated with cardiac injury in the low nanogram/milliliter range. Our results also demonstrate that these assays retain the necessary precision, reproducibility, and sensitivity to be applied to novel and uncharacterized candidate biomarkers for verification of proteins in blood. Discovery of disease-specific biomarkers with diagnostic and prognostic utility has become an important challenge in clinical proteomics. In general, unbiased discovery experiments often result in the confident identification of thousands of proteins, hundreds of which may vary significantly between case and control samples in small discovery studies. However, because of the stochastic sampling of proteomes in discovery "omics" experiments, a large fraction of the protein biomarkers "discovered" in these experiments are false positives arising from biological or technical variability. Clearly discovery omics experiments do not lead to biomarkers of immediate clinical utility but rather produce candidates that must be qualified and verified in larger sample sets than were used for discovery (1Rifai N. Gillette M.A. Carr S.A. Protein biomarker discovery and validation: the long and uncertain path to clinical utility.Nat. Biotechnol. 2006; 24: 971-983Crossref PubMed Scopus (1383) Google Scholar). Traditional, clinical validation of biomarkers has relied primarily on immunoassays because of their specificity and sensitivity for the target analyte and high throughput capability. However, antibody reagents for a clinical grade immunoassay often only exist for a short list of candidates. The development of a reliable sandwich immunoassay for one target protein is expensive, has a long development time, and is dependent upon the generation of high quality protein antibodies. For the large majority of new, unproven candidate biomarkers, an intermediate verification technology is required that has shorter assay development time lines, lower assay cost, and effective multiplexing of dozens of candidates in low sample volumes. Ideally the approach should be capable of analyzing hundreds of samples of serum or plasma with good precision. The desired outcome of verification is a small number of highly credentialed candidates suitable for traditional preclinical and clinical validation studies. Multiple reaction monitoring (MRM) 1The abbreviations used are:MRMmultiple reaction monitoringSIDstable isotope dilutionCVcoefficient of variationPMIplanned myocardial infarctionCRPC-reactive proteinMRP14myeloid related protein 14MPOmyeloperoxidasecTnIcardiac troponin IcTnTcardiac troponin TBNPB-type natriuretic peptideNT-proBNPN-terminal prohormone B-type natriuretic peptideIL-33interleukin 33sCD40Lsoluble CD40 ligandSCXstrong cation exchange chromatographyLOQlimit of quantitationLODlimit of detectionSISCAPAStable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies. coupled with stable isotope dilution (SID) MS has recently been shown to be well suited for direct quantification of proteins in plasma (2Kuhn E. Wu J. Karl J. Liao H. Zolg W. Guild B. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.Proteomics. 2004; 4: 1175-1186Crossref PubMed Scopus (369) Google Scholar, 3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar, 4Bondar O.P. Barnidge D.R. Klee E.W. Davis B.J. Klee G.G. LC-MS/MS quantification of Zn-alpha 2 glycoprotein: A potential serum biomarker for prostate cancer.Clin. Chem. 2007; 53: 673-678Crossref PubMed Scopus (106) Google Scholar) and has emerged as the core technology for candidate biomarker verification. MRM assays can be highly multiplexed such that a moderate number of candidate proteins (in the range of 10–50) can be simultaneously targeted and measured in the statistically viable number of patient samples required for verification (hundreds of serum samples). However, sensitivity for unambiguous detection and quantification of proteins by MS-based assays is often constrained by sample complexity, particularly when the measurements are being made in complex fluids such as plasma. multiple reaction monitoring stable isotope dilution coefficient of variation planned myocardial infarction C-reactive protein myeloid related protein 14 myeloperoxidase cardiac troponin I cardiac troponin T B-type natriuretic peptide N-terminal prohormone B-type natriuretic peptide interleukin 33 soluble CD40 ligand strong cation exchange chromatography limit of quantitation limit of detection Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies. Many biomarkers of current clinical importance, such as prostate-specific antigen and the cardiac troponins, reside in the low nanogram/milliliter range in plasma and, until recently, have been inaccessible by non-antibody approaches. Our laboratory has recently shown for the first time that a combination of abundant protein depletion with limited fractionation at the peptide level prior to SID-MRM-MS provides robust limits of quantitation (LOQs) in the 1–20 ng/ml range with coefficient of variation (CV) of 10–20% at the LOQ for proteins in plasma (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar). Here we demonstrate that this work flow can be extended to configure assays for a number of known markers of cardiovascular disease and, more importantly, can be deployed to measure their concentrations in clinical samples. We modeled a verification study comprising six patients undergoing alcohol septal ablation treatment for hypertrophic obstructive cardiomyopathy, a human model of "planned" myocardial infarction (PMI), and obtained targeted, quantitative measurements for moderate to low concentrations of cardiac biomarkers in plasma. This work provides additional evidence that MS-based assays can be configured and applied to verification of new protein targets for which high quality antibody reagents are not available. A total of six patients undergoing PMI using alcohol septal ablation for the treatment of symptomatic hypertrophic obstructive cardiomyopathy were included in this study. The protocol for obtaining blood from patients was approved by the Massachusetts General Hospital Institutional Review Board, and all subjects gave written informed consent. Inclusion criteria for patients to receive alcohol ablation treatment were as described previously (5Lewis G.D. Wei R. Liu E. Yang E. Shi X. Martinovic M. Farrell L. Asnani A. Cyrille M. Ramanathan A. Shaham O. Berriz G. Lowry P.A. Palacios I.F. Ta°an M. Roth F.P. Min J. Baumgartner C. Keshishian H. Addona T. Mootha V.K. Rosenzweig A. Carr S.A. Fifer M.A. Sabatine M.S. Gerszten R.E. Metabolite profiling of blood from individuals undergoing planned myocardial infarction reveals early markers of myocardial injury.J. Clin. Investig. 2008; 118: 3503-3512Crossref PubMed Scopus (233) Google Scholar). The most proximal accessible septal branch was instrumented using standard angioplasty guiding catheters and guide wires and 1.5 or 2.0-mm × 9-mm MaverickTM balloon catheters. Radiographic and echocardiographic contrast injections confirmed proper selection of the septal branch and balloon catheter position. Ethanol was infused through the balloon catheter at 1 ml/min. Additional injections in the same or other septal branches were administered as needed, causing cessation of blood flow to the isolated myocardium, and to reduce the gradient in the left ventricular outflow tract caused by the excessive heart muscle to <20 mm Hg (6Baggish A.L. Smith R.N. Palacios I. Vlahakes G.J. Yoerger D.M. Picard M.H. Lowry P.A. Jang I.K. Fifer M.A. Pathological effects of alcohol septal ablation for hypertrophic obstructive cardiomyopathy.Heart. 2006; 92: 1773-1778Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar). Blood was drawn from femoral venous catheters at base line (just prior to the onset of the ablation) and at 10 min, 1 h, 2 h, 4 h, and 24 h following the onset of injury. Samples were collected in K2EDTA-treated tubes (BD Biosciences). All blood samples were centrifuged at 2000 × g for 10 min to pellet cellular elements within 10 min of sample collection. The supernatant plasma was then aliquoted and immediately frozen at −80 °C to minimize freeze-thaw degradation. Additional blood samples were sent to the clinical chemistry laboratory for evaluation of the standard cardiac markers creatine kinase, creatine kinase MB, and troponin T (Roche Diagnostics). For this study, only plasma sampled at base line and 4 and 24 h postinjury was analyzed by the targeted LC-MS/MS-based approach. Supplemental Table 1 lists the protein targets and their "signature peptides" for which final MRM assays were configured. Signature peptides have both high responses in electrospray LC-MS/MS and are sequence-unique when searched against a non-redundant human protein database (NCBInr). Signature peptides were identified for each protein by tryptic digest of the protein standards and analysis of the resulting peptides on a LTQ ion trap mass spectrometer as described previously (Fig. 1A) (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar). C-reactive protein, sCD40L, myeloperoxidase, cardiac troponin T, and cardiac troponin I were purchased from EMD Chemicals Inc. (San Diego, CA); BNP and NT-proBNP were purchased from United States Biological (Swampscott, MA); and IL-33 was a kind gift from Dr. Richard Lee (Brigham and Women's Hospital, Boston, MA). Peptides for MRP14 were chosen based on previous knowledge. The detailed criteria for selection of peptides for synthesis and ultimately for assay configuration were described previously (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar). Stable isotope-labeled amino acids, [13C6]leucine (98.4 atom % isotopic enrichment), [13C6]isoleucine, and [13C5]valine (98 atom % isotopic enrichment) were purchased from Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA). Twenty-seven peptides derived from the target proteins were synthesized with a single, uniformly labeled [13C6]leucine, [13C6]isoleucine, or [13C5]valine using standard Fmoc (N-(9-fluorenyl)methoxycarbonyl) chemistry (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA). Unlabeled 12C forms of each peptide were synthesized by GL Biochem. For methionine-containing peptides derived from cardiac troponin T, NT-proBNP, and BNP-32, the sulfoxide forms of the same sequence were synthesized to account for this modification during sample processing. Synthetic peptides were purified to >90% purity and analyzed by amino acid analysis (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA). Calculations of concentration were based upon the amino acid analysis. Plasma from all patients and time points was processed as described previously (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar) (Fig. 1C). Briefly volumes of 0.8–1.2 ml of plasma per time point per patient were depleted of 12 high abundance proteins using an IgY-12 high capacity LC10 column (12.7 × 79 mm; GenWay Biotech, San Diego, CA) according to the manufacturer's instructions. Depleted plasma was concentrated to the original starting volume via Vivaspin 15R concentrators (5000 molecular weight cutoff; Vivascience, Hannover, Germany). Protein concentration of depleted, concentrated plasma was determined by Coomassie Plus Bradford assay (Pierce) and was 4.5 ± 1.1 mg/ml. 100 µl of depleted patient plasma was denatured with 6 m urea, 10 mm Tris, pH 8.0; reduced with 20 mm dithiothreitol at 37 °C for 30 min; and alkylated with 50 mm iodoacetamide at room temperature in the dark for 30 min. Urea concentration was diluted 10-fold with water prior to overnight digestion at 37 °C with porcine trypsin (sequencing grade modified; Promega, Madison, WI) using a 1:50 (w/w) enzyme to substrate ratio. Digests were terminated with formic acid to a final concentration of 1% and desalted using Oasis HLB 1cc (30 mg) reversed phase cartridges (Waters) as described previously (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar). Eluates were frozen, dried to dryness via vacuum centrifugation, and stored at −80 °C. Digested plasma samples from each patient and time point were normalized to total protein amount such that ∼350 µg of total protein was injected per patient per time point. Each sample was processed in duplicate. Detailed methods for SCX fractionation can be found in Keshishian et al. (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar). Briefly the fractionation was done on an Agilent 1100 capillary LC system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) using a BioBasic 1 × 250-mm column (ThermoFisher, San Jose, CA) at a flow rate of 50 µl/min and mobile phases that consisted of 5 mm potassium phosphate in 25% acetonitrile, pH 3.0 (A) and 500 mm potassium chloride in 5 mm potassium phosphate, 25% acetonitrile, pH 3.0 (B). After loading the sample onto the column, the mobile phase was held at 1% B for 15 min. Peptides were then separated with a linear gradient of 1–20% B in 20 min, 20–40% B in 10 min, and 40–100% B in 10 min. Fractions were collected every minute, and acetonitrile was removed from collected fractions by vacuum centrifugation. The elution profile of the peptide internal standards was predefined and used to generate seven pools of SCX fractions for MRM analysis per patient per time point (Fig. 1B). Each pool was desalted using Oasis HLB 1cc (10 mg) reversed phase cartridges as described previously (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar) and stored at −80 °C until LC-MRM/MS analysis. To ensure detection of peptides that eluted in or near the void volume of the SCX column (e.g. fractions 1–2), the flow-through was desalted and analyzed by LC-MRM/MS. Pooled SCX fractions were reconstituted in 25 µl of 5% formic acid, 3% acetonitrile and spiked with a mixture of 13C-labeled peptides for a final concentration of 5 fmol/µl. Nano-LC-MRM/MS/MS was performed on a 4000 Q Trap hybrid triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometer coupled to a Tempo LC system (Applied Biosystems, Foster City, CA). Chromatography was performed with Solvent A (0.1% formic acid) and Solvent B (90% acetonitrile in 0.1% formic acid). Full loop injection of 1 µl of each sample was done in triplicate on PicoFrit columns (75-µm inner diameter, 10-µm tip opening; New Objective, Woburn, MA) packed in house with 11–12 cm of ReproSil-Pur C18-AQ 3-µm reversed phase resin (Dr. Maisch, GmbH). Sample was eluted at 300 nl/min with a gradient of 3–20% Solvent B for 3 min, 20–55% solvent B for 35 min, and 55–80% solvent B for 3 min. Data were acquired with an ion spray voltage of 2200 V, curtain gas of 20 p.s.i., nebulizer gas of 3 p.s.i., and an interface heater temperature of 150 °C. Collision energy (7Lakkis N.M. Nagueh S.F. Kleiman N.S. Killip D. He Z.X. Verani M.S. Roberts R. Spencer 3rd, W.H. Echocardiography-guided ethanol septal reduction for hypertrophic obstructive cardiomyopathy.Circulation. 1998; 98: 1750-1755Crossref PubMed Scopus (213) Google Scholar), declustering potential and collision cell exit potential were optimized for maximum transmission and sensitivity of each MRM transition with infusion of each peptide standard and the Quantification Optimization function provided in Analyst (Fig. 1B). Identical declustering potential, collision energy, and collision cell exit potential values were used for each 12C/13C pair. A dwell time of 10–75 ms was used for different SCX fraction pools based upon the number of peptides and transitions monitored in that pool. In all experiments cycle times did not exceed 1 s, and a minimum of five to six data points were collected per peak. Three MRM transitions per peptide (supplemental Table 1) were monitored and acquired at unit resolution both in the first and third quadrupoles (Q1 and Q3) to maximize specificity. In general, transitions were chosen based upon relative abundance and m/z greater than the precursor m/z in the full-scan MS/MS spectrum recorded on the 4000 Q Trap mass spectrometer. The final MRM method included 162 optimized MRMs for nine target proteins. These MRMs were distributed among seven SCX fractions in accordance with the elution profile of the synthetic peptides. Data analysis was performed using MultiQuantTM software (AB/MDS Sciex, Foster City, CA). The relative ratios of the three transitions selected and optimized for the final MRM assay were predefined in the absence of plasma (i.e. in buffer) for each peptide using the 13C internal standards (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar). The most abundant transition for each pair was used for quantification unless interference from the matrix was observed. In these cases, another transition free of interference was chosen for quantification. 12C/13C peak area ratios were used to calculate concentrations of target proteins in plasma by the following equation: Measured concentration = (Peak area ratio)(5 fmol/µl internal standard)(Protein molecular weight)(Analysis volume)/(Process volume)/1000 (see above). Intra-assay imprecision (CV) for each peptide was based on the calculated average protein concentration for a set of triplicate injections. Interassay CV was calculated for each peptide from two process replicates per time point per patient. All data are summarized in supplemental Table 2. The limit of detection (LOD) and LOQ for each signature peptide derived from the target proteins were determined in SCX matrix by the method of standard addition. Female plasma from a healthy donor was immunoaffinity-depleted, digested, and SCX-fractionated to generate SCX-fractionated plasma pools. Response curves ranging from 0.1 to 10 fmol/µl were generated for each 12C-peptide by spiking them into corresponding SCX pools. Labeled internal standard peptides were spiked in at a constant concentration of 5 fmol/µl prior to LC-MRM/MS. This concentration range is equivalent to 5–800 ng/ml of corresponding target proteins. For this study a modification of the Linnet and Kondratovich (8Linnet K. Kondratovich M. Partly nonparametric approach for determining the limit of detection.Clin. Chem. 2004; 50: 732-740Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar) method was used for calculating LOD. The LOD was based on the variance of the blank sample and the variance of the lowest level spike-in sample. Assuming a type I error rate α = 0.05 for deciding that the analyte is present when it is not and a type II error rate β = 0.05 for not detecting the analyte when it is present, the LOD was derived as follows.LOD=LOB+cβ×S.D.s(Eq. 1) The limit of blank (LOB) was defined as the 95th percentile of the blank samples. This was estimated as meanb + t1 − α × S.D.b where meanb and S.D.b are the mean and standard deviation of the blank sample, and S.D.s is the standard deviation of the low level spike. For a relatively small number of repeated measurements for the blank, cβ was approximated as t1 − β. t1 − α and t1 − β are the (1 − α) and (1 − β) percentile, respectively, of the standard t distribution on (n − 1) degrees of freedom where the blank and low level spike samples have n = 3 replicate measurements. In this study, the LOD for the sample is obtained from the three replications as measured by the best transition. When three values are averaged to obtain the final measurement, the LOD calculation requires the S.D. estimates to be divided by [rad]3[/rad] = 1.73. Because α = β = 0.05, the LOD equation becomes Equation 2.LOD=meanb+t0.95×(S.D.b+S.D.s)/n(Eq. 2) Once the LOD was determined separately for each transition of each peptide, the LOQ was calculated using the customary relation: LOQ = 3 × LOD (9Currie L.A. Limits for qualitative detection and quantitative determination.Anal. Chem. 1968; 40: 586-593Crossref Scopus (3626) Google Scholar). Depending on the LC-MS matrix in which the analyte is measured, an endogenous non-zero analyte level may exist even in the blank sample for some of the peptides under consideration. This endogenous level of an analyte was estimated by using the linear part of the concentration curve. A robust linear fit using least median squares regression (10Venables W.N. Ripley B.D. Venables W.N. Modern Applied Statistics with S. 4th Ed. Springer, New York2002Crossref Google Scholar) was performed. The 99% confidence interval of the regression line intercept was calculated using bootstrap estimation (11Davison A.C. Hinkley D.V. Bootstrap Methods and Their Application. Cambridge University Press, Cambridge, UK1997Crossref Google Scholar). If the lower limit of the confidence interval is positive, then the analyte is deemed to have an endogenous level equal to the regression intercept. If the lower 99% confidence interval is zero or negative, there is no expected endogenous level for that analyte. Plasma concentrations of CRP, MPO, MRP14, NT-proBNP, and cTnT for patients 1–3 before and after immunoaffinity depletion were determined by immunoassay at the Department of Laboratory Medicine at Children's Hospital (Boston, MA). Samples were analyzed by the following kits or systems: CRP, DiaSorin; MPO, Alpco; MRP14, Peninsula; NT-proBNP, Cobas, Roche Diagnostics; and cTnT, Elecsys TnT. Fig. 1 illustrates the strategy used for sample processing and assay configuration. Peptides derived from the target proteins (supplemental Table 1) were selected based upon experimental data obtained by tryptic digestion of standard protein and subsequent analysis by LC-MS/MS (Fig. 1A). Two to five peptides per protein were selected based upon criteria described previously (3Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 6: 2212-2229Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (575) Google Scholar) and synthesized both in 12C and 13C forms. Assay configuration was conducted to optimize the SCX peptide separation and MS instrument parameters to maximize detection of the target peptides (Fig. 1B). For peptide fractionation via SCX, the elution profile of all signature peptides was evaluated to determine the pooling strategy for patient samples. For MRM acquisition, three transitions per peptide were selected and monitored to achieve maximum selectivity and sensitivity in the MRM assay. Peptides that were synthesized but that did not make the final MRM assay after optimization were dropped because of poor electrospray response or poor chromatographic behavior by reversed phase. The final MRM assay included two to four peptides per protein (supplemental Table 1). Fig. 1C shows the final limited fractionation/MRM assay in which patient plasma was depleted of high abundance plasma proteins before reduction, alkylation, and tryptic digestion. Peptides were minimally fractioned by SCX, pooled according to a predefined elution profile, and analyzed by LC-MRM/MS following addition of heavy labeled internal peptide standards. Three technical replicates were performed for each fraction, and two process replicates were performed across all patients and time points. 12C-Peptides derived from each of the target proteins were added to SCX-fractionated plasma from a healthy donor to determine the LOD and LOQ for each peptide as described under "Materials and Methods." Response curves for all peptides are shown in supplemental Fig. 1. For seven of nine proteins, at least one signature peptide derived from the target protein had an LOD in plasma that ranged from 0.052 (cTnT) to 0.287 fmol/µl (MPO) and an LOQ in plasma that ranged from 0.157 to 0.862 fmol/µl (Table I). These molar concentrations are equivalent to 0.9–24 and 5–72 ng/ml target protein for LOD and LOQ, respectively. Values for LOD and LOQ listed in Table I for CRP and MRP14 reflect endogenous levels of these prote

Abstract Characterizing the interactions that SARS-CoV-2 viral RNAs make with host cell proteins during infection can improve our understanding of viral RNA functions and the host innate immune response. Using RNA antisense purification and mass spectrometry, we identified up to 104 human proteins that directly and specifically bind to SARS-CoV-2 RNAs in infected human cells. We integrated the SARS-CoV-2 RNA interactome with changes in proteome abundance induced by viral infection and linked interactome proteins to cellular pathways relevant to SARS-CoV-2 infections. We demonstrated by genetic perturbation that cellular nucleic acid-binding protein (CNBP) and La-related protein 1 (LARP1), two of the most strongly enriched viral RNA binders, restrict SARS-CoV-2 replication in infected cells and provide a global map of their direct RNA contact sites. Pharmacological inhibition of three other RNA interactome members, PPIA, ATP1A1, and the ARP2/3 complex, reduced viral replication in two human cell lines. The identification of host dependency factors and defence strategies as presented in this work will improve the design of targeted therapeutics against SARS-CoV-2.

Signaling pathways are orchestrated by post-translational modifications (PTMs) such as phosphorylation. However, pathway analysis of PTM data sets generated by mass spectrometry (MS)-based proteomics is typically performed at a gene-centric level because of the lack of appropriately curated PTM signature databases and bioinformatic tools that leverage PTM site-specific information. Here we present the first version of PTMsigDB, a database of modification site-specific signatures of perturbations, kinase activities and signaling pathways curated from more than 2,500 publications. We adapted the widely used single sample Gene Set Enrichment Analysis approach to utilize PTMsigDB, enabling

Rational strategies to prioritize candidate biomarkers should save resources and accelerate progress in diagnostics development. Addona et al. integrate proteomics into a pipeline for biomarker validation and use it to identify markers of cardiovascular injury in a scenario where patients serve as their own biological controls. We developed a pipeline to integrate the proteomic technologies used from the discovery to the verification stages of plasma biomarker identification and applied it to identify early biomarkers of cardiac injury from the blood of patients undergoing a therapeutic, planned myocardial infarction (PMI) for treatment of hypertrophic cardiomyopathy. Sampling of blood directly from patient hearts before, during and after controlled myocardial injury ensured enrichment for candidate biomarkers and allowed patients to serve as their own biological controls. LC-MS/MS analyses detected 121 highly differentially expressed proteins, including previously credentialed markers of cardiovascular disease and >100 novel candidate biomarkers for myocardial infarction (MI). Accurate inclusion mass screening (AIMS) qualified a subset of the candidates based on highly specific, targeted detection in peripheral plasma, including some markers unlikely to have been identified without this step. Analyses of peripheral plasma from controls and patients with PMI or spontaneous MI by quantitative multiple reaction monitoring mass spectrometry or immunoassays suggest that the candidate biomarkers may be specific to MI. This study demonstrates that modern proteomic technologies, when coherently integrated, can yield novel cardiovascular biomarkers meriting further evaluation in large, heterogeneous cohorts.