Patterns and bottlenecks A year into the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 pandemic, we are experiencing waves of new variants emerging. Some of these variants have worrying functional implications, such as increased transmissibility or antibody treatment escape. Lythgoe et al. have undertaken in-depth sequencing of more than 1000 hospital patients' isolates to find out how the virus is mutating within individuals. Overall, there seem to be consistent and reproducible patterns of within-host virus diversity. The authors observed only one or two variants in most samples, but a few carried many variants. Although the evidence indicates strong purifying selection, including in the spike protein responsible for viral entry, the authors also saw evidence for transmission clusters associated with households and other possible superspreader events. After transmission, most variants fizzled out, but occasionally some initiated ongoing transmission and wider dissemination. Science , this issue p. eabg0821

High-throughput viral genetic sequencing is needed to monitor the spread of drug resistance, direct optimal antiretroviral regimes, and to identify transmission dynamics in generalised HIV epidemics. Public health efforts to sequence HIV genomes at scale face three major technical challenges: (i) minimising assay cost and protocol complexity, (ii) maximising sensitivity, and (iii) recovering accurate and unbiased sequences of both the genome consensus and the within-host viral diversity. Here we present a novel, high-throughput, virus-enriched sequencing method and computational pipeline tailored specifically to HIV (veSEQ-HIV), which addresses all three technical challenges, and can be used directly on leftover blood drawn for routine CD4 testing. We demonstrate its performance on 1,620 plasma samples collected from consenting individuals attending 10 large urban clinics in Zambia, partners of HPTN 071 (PopART). We show that veSEQ-HIV consistently recovers complete HIV genomes from the majority of samples of different subtypes, and is also quantitative: the number of HIV reads per sample obtained by veSEQ-HIV estimates viral load without the need for additional testing. Both quantitativity and sensitivity were assessed on a subset of 126 samples with clinically measured viral loads, and with standardized quantification controls (VL 100 - 5,000,000 RNA copies/ml). Complete HIV genomes were recovered from 93% (85/91) of samples when viral load was over 1,000 copies per ml. The quantitative nature of the assay implies that variant frequencies estimated with veSEQ-HIV are representative of true variant frequencies in the sample. Detection of minority variants can be exploited for epidemiological analysis of transmission and drug resistance, and we show how the information contained in individual reads of a veSEQ-HIV sample can be used to detect linkage between multiple mutations associated with resistance to antiretroviral therapy. Less than 2% of reads obtained by veSEQ-HIV were identified as in silico contamination events using updates to the phyloscanner software (phyloscanner clean) that we show to be 95% sensitive and 99% specific at 'decontaminating' NGS data. The cost of the assay - approximately 45 USD per sample - compares favourably with existing VL and HIV genotyping tests, and provides the additional value of viral load quantification and inference of drug resistance with a single test. veSEQ-HIV is well suited to large public health efforts and is being applied to all ~9000 samples collected for the HPTN 071-2 (PopART Phylogenetics) study.* David Bonsall and Tanya Golubchik contributed equally. ** Mariateresa de Cesare and Mohammed Limbada contributed equally.

The ability to predict HIV-1 resistance to broadly neutralizing antibodies (bnAbs) will increase bnAb therapeutic benefits. Machine learning is a powerful approach for such prediction. One challenge is that some HIV-1 subtypes in currently available training datasets are underrepresented, which likely affects models9 generalizability across subtypes. A second challenge is that combinations of bnAbs are required to avoid the inevitable resistance to a single bnAb, and computationally determining optimal combinations of bnAbs is an unsolved problem. Recently, machine learning models trained using resistance outcomes for multiple antibodies at once, a strategy called multi-task learning (MTL), have been shown to achieve better performance in several cases than previous approaches. We develop a new model and show that, beyond the boost in performance, MTL also helps address the previous two challenges. Specifically, we demonstrate empirically that MTL can mitigate bias from underrepresented subtypes, and that MTL allows the model to learn patterns of co-resistance between antibodies, thus providing tools to predict antibodies9 epitopes and to potentially select optimal bnAb combinations. Our analyses, publicly available at https://github.com/iaime/LBUM, can be adapted to other infectious diseases that are treated with antibody therapy.

Abstract Extensive global sampling and whole genome sequencing of the pandemic virus SARS-CoV-2 have enabled researchers to characterise its spread, and to identify mutations that may increase transmission or enable the virus to escape therapies or vaccines. Two important components of viral spread are how frequently variants arise within individuals, and how likely they are to be transmitted. Here, we characterise the within-host diversity of SARS-CoV-2, and the extent to which genetic diversity is transmitted, by quantifying variant frequencies in 1390 clinical samples from the UK, many from individuals in known epidemiological clusters. We show that SARS-CoV-2 infections are characterised by low levels of within-host diversity across the entire viral genome, with evidence of strong evolutionary constraint in Spike, a key target of vaccines and antibody-based therapies. Although within-host variants can be observed in multiple individuals in the same phylogenetic or epidemiological cluster, highly infectious individuals with high viral load carry only a limited repertoire of viral diversity. Most viral variants are either lost, or occasionally fixed, at the point of transmission, consistent with a narrow transmission bottleneck. These results suggest potential vaccine-escape mutations are likely to be rare in infectious individuals. Nonetheless, we identified Spike variants present in multiple individuals that may affect receptor binding or neutralisation by antibodies. Since the fitness advantage of escape mutations in highly-vaccinated populations is likely to be substantial, resulting in rapid spread if and when they do emerge, these findings underline the need for continued vigilance and monitoring.

Abstract Background Owing to high levels of resistance to previous first-line non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTI)-based antiretroviral therapy (ART), consolidated recommendations since 2019, from the WHO and others, have indicated that dolutegravir (DTG) is the preferred drug of choice for HIV treatment, globally. There is a paucity of resistance outcome data from non-B HIV subtypes circulating across West Africa. Aim We aimed to characterise the mutational profiles of HIV-positive patients from a small North-East Nigeria cohort, failing a DTG-based ART regimen. Methods Plasma samples were collected and stored from 61 HIV-1 infected participants. Following failure of DTG-based ART, all samples were sequenced by Illumina whole-genome, ultra-deep sequencing. Sequencing was successful in (n=33) participants with median age of 40 years and median time on ART of 9 years. HIV-1 subtyping was performed using SNAPPy. Haplotype reconstruction and transmission were inferred using standard phylogenetic methods. Result Most patients had mutational profiles that were reflective of prior exposure to first- and second-line ART including exposure to thymidine analogues, efavirenz and nevirapine. One patient had evidence of major INSTI DRMs (T66A, G118R, E138K and R263K), reducing efficacy of DTG. The participant was aged 18, infected with a subtype G virus and likely vertically infected. Conclusion This study found low level resistance to DTG in the cohort, with one patient having high-level resistance to DTG and other INSTIs. Critical population level and long-term data on DTG outcomes are required to guide implementation and policy action across the region.

By developing a high-density murine immunophenotyping platform compatible with high-throughput genetic screening, we have established profound contributions of genetics and structure to immune variation. Specifically, high-throughput phenotyping of 530 knockout mouse lines identified 140 monogenic “hits” (>25%), most of which had never hitherto been implicated in immunology. Furthermore, they were conspicuously enriched in genes for which humans show poor tolerance to loss-of-function. The immunophenotyping platform also exposed dense correlation networks linking immune parameters with one another and with specific physiologic traits. By limiting the freedom of individual immune parameters, such linkages impose genetically regulated “immunological structures”, whose integrity was found to be associated with immunocompetence. Hence, our findings provide an expanded genetic resource and structural perspective for understanding and monitoring immune variation in health and disease.

Viral genetic information from people living with HIV can deepen our understanding of the infection’s epidemiology at many scales. To better understand the potentials and limits of tools that utilise such information, we show the performance of two representative tools (HIV-TRACE and phyloscanner) in describing HIV transmission dynamics, with different types of genetic data, and compare with previous findings. The samples were collected from three cohort studies in Sub-Saharan Africa and were deep sequenced to produce both short Illumina reads and long PacBio reads. By comparing phyloscanner’s performance with short and long reads, we show that long reads provide improved phylogenetic resolution for the classic transmission topology in joint within-host trees. Our pipeline accurately predicted the direction of transmission 88%-92% of the time. We also show that the timing of sample collection plays an important role in the reconstruction of directionality using deep sequencing data. Consensus sequences were also generated and used as HIV-TRACE input to show different patterns of clustering sensitivity and specificity for data from different genomic regions or the entire genome. Finally, we discuss adjusting expectations about sensitivity and specificity of different types of sequence data, considering rapid pathogen evolution, and highlight the potentials of high within-host phylogenetic resolution in HIV. In conclusion, viral genetic data collected and presented differently could greatly influence our ability to describe the underlying dynamics. Methods for source attribution analysis have reached levels of superior accuracy. However, residual uncertainty emphasizes sequence analysis alone cannot conclusively prove linkage at the individual level.