Abstract Natural evolution must explore a vast landscape of possible sequences for desirable yet rare mutations, suggesting that learning from natural evolutionary strategies could accelerate artificial evolution. Here, we report that deep learning algorithms known as protein language models can evolve human antibodies with high efficiency, despite providing the models with no information about the target antigen, binding specificity, or protein structure, and also requiring no additional task-specific finetuning or supervision. We performed language-model-guided affinity maturation of seven diverse antibodies, screening 20 or fewer variants of each antibody across only two rounds of evolution. Our evolutionary campaigns improved the binding affinities of four clinically relevant antibodies up to 7-fold and three unmatured antibodies up to 160-fold across diverse viral antigens, with many designs also demonstrating improved thermostability and viral neutralization activity. Notably, our algorithm requires only a single wildtype sequence and computes recommended amino acid changes in less than a second. Moreover, the same models that improve antibody binding also guide efficient evolution across diverse protein families and selection pressures, indicating that these results generalize to many natural settings. Contrary to prevailing notions of evolution as difficult and resource-intensive, our results suggest that when constrained to a narrow manifold of evolutionary plausibility, evolution can become much easier, which we refer to as the “efficient manifold hypothesis.”

ABSTRACT Early stages of deadly respiratory diseases such as COVID-19 have been challenging to elucidate due to lack of an experimental system that recapitulates the cellular and structural complexity of the human lung while allowing precise control over disease initiation and systematic interrogation of molecular events at cellular resolution. Here we show healthy human lung slices cultured ex vivo can be productively infected with SARS-CoV-2, and the cellular tropism of the virus and its distinct and dynamic effects on host cell gene expression can be determined by single cell RNA sequencing and reconstruction of “infection pseudotime” for individual lung cell types. This revealed that the prominent SARS-CoV-2 target is a population of activated interstitial macrophages (IMs), which as infection proceeds accumulate thousands of viral RNA molecules per cell, comprising up to 60% of the cellular transcriptome and including canonical and novel subgenomic RNAs. During viral takeover of IMs, there is cell-autonomous induction of a pro-fibrotic program ( TGFB1 , SPP1 ), and an inflammatory program characterized by the early interferon response, chemokines ( CCL2 , 7, 8 , 13, CXCL10 ) and cytokines ( IL6, IL10) , along with destruction of cellular architecture and formation of dense viral genomic RNA bodies revealed by super-resolution microscopy. In contrast, alveolar macrophages (AMs) showed neither viral takeover nor induction of a substantial inflammatory response, although both purified AMs and IMs supported production of infectious virions. Spike-dependent viral entry into AMs was neutralized by blockade of ACE2 or Sialoadhesin/CD169, whereas IM entry was neutralized only by DC-SIGN/CD209 blockade. These results provide a molecular characterization of the initiation of COVID-19 in human lung tissue, identify activated IMs as a prominent site of viral takeover and focus of inflammation and fibrosis, and suggest therapeutic targeting of the DC-SIGN/CD209 entry mechanism to prevent IM infection, destruction and early pathology in COVID-19 pneumonia. Our approach can be generalized to define the initiation program and evaluate therapeutics for any human lung infection at cellular resolution.

ABSTRACT A major challenge in vaccine development, especially against rapidly evolving viruses, is the ability to focus the immune response toward evolutionarily conserved antigenic regions to confer broad protection. For example, while many broadly neutralizing antibodies against influenza have been found to target the highly conserved stem region of hemagglutinin (HA-stem), the immune response to seasonal influenza vaccines is predominantly directed to the immunodominant but variable head region (HA-head), leading to narrow-spectrum efficacy. Here, we first introduce an approach to controlling antigen orientation based on the site-specific insertion of short stretches of aspartate residues (oligoD) that facilitates antigen-binding to alum adjuvants. We demonstrate the generalizability of this approach to antigens from the Ebola virus, SARS-CoV-2, and influenza and observe enhanced antibody responses following immunization in all cases. Next, we use this approach to reorient HA in an “upside down” configuration, which we envision increases HA-stem exposure, therefore also improving its immunogenicity compared to HA-head. When applied to HA of H2N2 A/Japan/305/1957, the reoriented H2 HA (reoH2HA) on alum induced a stem-directed antibody response that cross-reacted with both group 1 and 2 influenza A HAs. Our results demonstrate the possibility and benefits of antigen reorientation via oligoD insertion, which represents a generalizable immunofocusing approach readily applicable for designing epitope-focused vaccine candidates. GRAPHICAL ABSTRACT Seasonal influenza vaccines induce a biased antibody response against the variable head of hemagglutinin, whereas conserved epitopes on the stem are a target for universal vaccines. Here we show that reorienting HA in an “upside-down” configuration sterically occludes the head and redirects the antibody response to the more exposed stem, thereby inducing broad cross-reactivity against hemagglutinins from diverse influenza strains.

Abstract Taurine is a conditionally essential micronutrient and one of the most abundant amino acids in humans 1–3 . In endogenous taurine metabolism, dedicated enzymes are involved in the biosynthesis of taurine from cysteine and in the downstream metabolism of secondary taurine metabolites 4,5 . One taurine metabolite is N -acetyltaurine 6 . Levels of N -acetyltaurine are dynamically regulated by stimuli that alter taurine or acetate flux, including endurance exercise 7 , dietary taurine supplementation 8 and alcohol consumption 6,9 . So far, the identities of the enzymes involved in N -acetyltaurine metabolism, and the potential functions of N -acetyltaurine itself, have remained unknown. Here we show that the body mass index associated orphan enzyme phosphotriesterase-related (PTER) 10 is a physiological N -acetyltaurine hydrolase. In vitro, PTER catalyses the hydrolysis of N -acetyltaurine to taurine and acetate. In mice, PTER is expressed in the kidney, liver and brainstem. Genetic ablation of Pter in mice results in complete loss of tissue N -acetyltaurine hydrolysis activity and a systemic increase in N -acetyltaurine levels. After stimuli that increase taurine levels, Pter knockout mice exhibit reduced food intake, resistance to diet-induced obesity and improved glucose homeostasis. Administration of N -acetyltaurine to obese wild-type mice also reduces food intake and body weight in a GFRAL-dependent manner. These data place PTER into a central enzymatic node of secondary taurine metabolism and uncover a role for PTER and N -acetyltaurine in body weight control and energy balance.

ABSTRACT Ferroptosis, a form of non-apoptotic cell death program driven by excessive lipid peroxidation and an important mechanism of tumor suppression, is frequently dysregulated in cancer. However, the mechanisms underlying impaired ferroptosis in oncogene-specific tumors remain poorly understood. Here we report a non- canonical role of lactate dehydrogenase B (LDHB), whose main activity is the conversion of lactate to pyruvate, in protecting KRAS-mutated lung cancer from ferroptosis. Silencing of LDHB impairs intracellular glutathione (GSH) metabolism and drives the hypersensitivity of KRAS -mutant cells to ferroptosis inducers by inhibiting the SLC7A11/GSH/GPX4 axis, a central antioxidant system against lipid peroxidation and ferroptosis by catalyzing GSH synthesis and utilization. Mechanistically, LDHB promotes SLC7A11 expression and GSH biosynthesis, and inhibition of LDHB confers metabolic synthetic lethality with ferroptosis inducers due to increased glutaminolysis and production of reactive oxygen species (ROS) in mitochondria, ultimately triggering ferroptosis of KRAS -driven lung cancer cells. Consequently, combined inhibition of LDHB and SLC7A11 synergistically suppresses tumor growth in multiple KRAS -mutant lung cancer implants and in an autochthonous model of Kras -induced lung adenocarcinoma. Taken together, our results reveal a hitherto unrecognized mechanism of ferroptosis defense by glycolytic LDHB and suggest a new strategy for the treatment of KRAS -dependent lung cancer.

Summary Taurine is a conditionally essential micronutrient and one of the most abundant amino acids in humans 1–3 . In endogenous taurine metabolism, dedicated enzymes are involved in biosynthesis of taurine from cysteine as well as the downstream derivatization of taurine into secondary taurine metabolites 4,5 . One such taurine metabolite is N-acetyltaurine 6 . Levels of N-acetyltaurine are dynamically regulated by diverse physiologic perturbations that alter taurine and/or acetate flux, including endurance exercise 7 , nutritional taurine supplementation 8 , and alcohol consumption 6,9 . While taurine N-acetyltransferase activity has been previously detected in mammalian cells 6,7 , the molecular identity of this enzyme, and the physiologic relevance of N-acetyltaurine, have remained unknown. Here we show that the orphan body mass index-associated enzyme PTER (phosphotriesterase-related) 10 is the principal mammalian taurine N-acetyltransferase/hydrolase. In vitro, recombinant PTER catalyzes bidirectional taurine N-acetylation with free acetate as well as the reverse N-acetyltaurine hydrolysis reaction. Genetic ablation of PTER in mice results in complete loss of tissue taurine N-acetyltransferase/hydrolysis activities and systemic elevation of N-acetyltaurine levels. Upon stimuli that increase taurine levels, PTER-KO mice exhibit lower body weight, reduced adiposity, and improved glucose homeostasis. These phenotypes are recapitulated by administration of N-acetyltaurine to wild-type mice. Lastly, the anorexigenic and anti-obesity effects of N-acetyltaurine require functional GFRAL receptors. Together, these data uncover enzymatic control of a previously enigmatic pathway of secondary taurine metabolism linked to energy balance.

ABSTRACT Ebola virus causes hemorrhagic fever in humans and poses a significant threat to global public health. Although two viral vector vaccines have been approved to prevent Ebola virus disease, they are distributed in the limited ring vaccination setting and only indicated for prevention of infection from orthoebolavirus zairense (EBOV) – one of three orthoebolavirus species that have caused previous outbreaks. Ebola virus glycoprotein GP mediates viral infection and serves as the primary target of neutralizing antibodies. Here we describe a universal Ebola virus vaccine approach using structure-guided design of candidates with hyperglycosylation that aims to direct antibody responses away from variable regions and toward conserved epitopes of GP. We first determined the hyperglycosylation landscape on Ebola virus GP and used that to generate hyperglycosylated GP variants with two to four additional glycosylation sites to mask the highly variable glycan cap region. We then created vaccine candidates by displaying wild-type or hyperglycosylated GP variants on ferritin nanoparticles (Fer). Immunization with these antigens elicited potent neutralizing antisera against EBOV in mice. Importantly, we observed consistent cross-neutralizing activity against Bundibugyo virus and Sudan virus from hyperglycosylated GP-Fer with two or three additional glycans. In comparison, elicitation of cross-neutralizing antisera was rare in mice immunized with wild-type GP-Fer. These results demonstrate a potential strategy to develop universal Ebola virus vaccines that confer cross-protective immunity against existing and emerging filovirus species. SIGNIFICANCE STATEMENT Ebola virus outbreaks cause hemorrhagic fever with high mortality rates. Current viral vaccines require cold-chain storage and are distributed in limited ring vaccination settings. They are only indicated for protection against orthoebolavirus zairense (EBOV), one of three human-pathogenic Ebola virus species. Here we harness hyperglycosylation as an immunofocusing approach to design universal Ebola virus vaccine candidates based on Ebola virus glycoprotein (GP) displayed on ferritin nanoparticles (Fer). Compared with wild-type GP-Fer, immunization with hyperglycosylated GP-Fer elicited potently neutralizing antisera against EBOV, and more importantly, consistent cross-neutralizing activity against the other two orthoebolavirus species. Our work shows that immunofocusing antibody responses toward conserved and neutralizing epitopes of GP represents a promising strategy for vaccine design against antigenically diverse Ebola virus species.

Assessing the glymphatic system activity using diffusion tensor imaging analysis along with the perivascular space (DTI-ALPS) may be helpful to understand the pathophysiology of moyamoya disease (MMD). 63 adult patients with MMD and 20 healthy controls (HCs) were included for T1-weighted images, T2-FLAIR, pseudocontinuous arterial spin labeling, and DTI. 60 patients had digital subtraction angiography more than 6 months after combined revascularization. The Suzuki stage, postoperative Matsushima grade, periventricular anastomoses (PA), enlarged perivascular spaces (EPVS), deep and subcortical white matter hyperintensities (DSWMH), DTI-ALPS, cerebral blood flow (CBF), and cognitive scales of MMD patients were assessed. MMD patients were divided into early and advanced stage based on the Suzuki stage. We detected lower DTI-ALPS in patients with advanced stage relative to HCs (p = 0.046) and patients with early stage (p = 0.004), hemorrhagic MMD compared with ischemic MMD (p = 0.048), and PA Grade 2 compared with Grade 0 (p = 0.010). DTI-ALPS was correlated with the EPVS in basal ganglia (r = -0.686, p < 0.001), Suzuki stage (r = -0.465, p < 0.001), DSWMH (r = -0.423, p = 0.001), and global CBF (r = 0.300, p = 0.017) and cognitive scores (r = 0.343, p = 0.018). The DTI-ALPS of patients with good postoperative collateral formation was higher compared to those with poor postoperative collateral formation (p = 0.038). In conclusion, the glymphatic system was impaired in advanced MMD patients and may affected cognitive function and postoperative neoangiogenesis.