Major aims of single-cell proteomics include increasing the consistency, sensitivity, and depth of protein quantification, especially for proteins and modifications of biological interest. To simultaneously advance all these aims, we developed prioritized Single Cell ProtEomics (pSCoPE). pSCoPE consistently analyzes thousands of prioritized peptides across all single cells (thus increasing data completeness) while analyzing identifiable peptides at full duty-cycle, thus increasing proteome depth. These strategies increased the sensitivity, data completeness, and proteome coverage over 2-fold. The gains enabled quantifying protein variation in untreated and lipopolysaccharide-treated primary macrophages. Within each condition, proteins covaried within functional sets, including phagosome maturation and proton transport. This protein covariation within a treatment condition was similar across the treatment conditions and coupled to phenotypic variability in endocytic activity. pSCoPE also enabled quantifying proteolytic products, suggesting a gradient of cathepsin activities within a treatment condition. pSCoPE is freely available and widely applicable, especially for analyzing proteins of interest without sacrificing proteome coverage. Support for pSCoPE is available at: scp.slavovlab.net/pSCoPE Abstract Figure

Current mass-spectrometry methods enable high-throughput proteomics of large sample amounts, but proteomics of low sample amounts remains limited in depth and throughput. To increase the throughput of sensitive proteomics, we developed an experimental and computational framework, plexDIA, for simultaneously multiplexing the analysis of both peptides and samples. Multiplexed analysis with plexDIA increases throughput multiplicatively with the number of labels without reducing proteome coverage or quantitative accuracy. By using 3-plex nonisobaric mass tags, plexDIA enables quantifying 3-fold more protein ratios among nanogram-level samples. Using 1 hour active gradients and first-generation Q Exactive, plexDIA quantified about 8,000 proteins in each sample of labeled 3-plex sets. plexDIA also increases data completeness, reducing missing data over 2-fold across samples. We applied plexDIA to quantify proteome dynamics during the cell division cycle in cells isolated based on their DNA content; plexDIA detected many classical cell cycle proteins and discovered new ones. When applied to single human cells, plexDIA quantified about 1,000 proteins per cell and achieved 98 % data completeness within a plexDIA set while using about 5 min of active chromatography per cell. These results establish a general framework for increasing the throughput of sensitive and quantitative protein analysis.

The physiological response of a cell to stimulation depends on its proteome configuration. Therefore, the abundance variation of regulatory proteins across unstimulated single cells can be associatively linked with their response to stimulation. Here we developed an approach that leverages this association across individual cells and nuclei to systematically identify potential regulators of biological processes, followed by targeted validation. Specifically, we applied this approach to identify regulators of nucleocytoplasmic protein transport in macrophages stimulated with lipopolysaccharide (LPS). To this end, we quantified the proteomes of 3,412 individual nuclei, sampling the dynamic response to LPS treatment, and linking functional variability to proteomic variability. Minutes after the stimulation, the protein transport in individual nuclei correlated strongly with the abundance of known protein transport regulators, thus revealing the impact of natural protein variability on functional cellular response. We found that simple biophysical constraints, such as the quantity of nuclear pores, partially explain the variability in LPS-induced nucleocytoplasmic transport. Among the many proteins newly identified to be associated with the response, we selected 16 for targeted validation by knockdown. The knockdown phenotypes confirmed the inferences derived from natural protein and functional variation of single nuclei, thus demonstrating the potential of (sub-)single-cell proteomics to infer functional regulation. We expect this approach to generalize to broad applications and enhance the functional interpretability of single-cell omics data.

Abstract Pre-patterning of the embryo, driven by spatially localized factors, is a common feature across several non-mammalian species 1–4 . However, mammals display regulative development and thus it was thought that blastomeres of the embryo do not show such pre-patterning, contributing randomly to the three lineages of the blastocyst: the epiblast, primitive endoderm and trophectoderm that will generate the new organism, the yolk sac and placenta respectively 4–6 . Unexpectedly, early blastomeres of mouse and human embryos have been reported to have distinct developmental fates, potential and heterogeneous abundance of certain transcripts 7–12 . Nevertheless, the extent of the earliest intra-embryo differences remains unclear and controversial. Here, by utilizing multiplexed and label-free single-cell proteomics by mass-spectrometry 13 , we show that 2-cell mouse and human embryos contain an alpha and a beta blastomere as defined by differential abundance of hundreds of proteins exhibiting strong functional enrichment for protein synthesis, transport, and degradation. Such asymmetrically distributed proteins include Gps1 and Nedd8, depletion or overexpression of which in one blastomere of the 2-cell embryo impacts lineage segregation. These protein asymmetries increase at 4-cell stage. Intriguingly, halved mouse zygotes display asymmetric protein abundance that resembles alpha and beta blastomeres, suggesting differential proteome localization already within zygotes. We find that beta blastomeres give rise to a blastocyst with a higher proportion of epiblast cells than alpha blastomeres and that vegetal blastomeres, which are known to have a reduced developmental potential, are more likely to be alpha. Human 2-cell blastomeres also partition into two clusters sharing strong concordance with clusters found in mouse, in terms of differentially abundant proteins and functional enrichment. To our knowledge, this is the first demonstration of intra-zygotic and inter-blastomere proteomic asymmetry in mammals that has a role in lineage segregation.

Abstract Accurate protein quantification is key to identifying protein markers, regulatory relationships between proteins, and pathophysiological mechanisms. Realizing this potential requires sensitive and deep protein analysis of a large number of samples. Toward this goal, proteomics throughput can be increased by parallelizing the analysis of both precursors and samples using multiplexed data independent acquisition (DIA) implemented by the plexDIA framework: https://plexDIA.slavovlab.net . Here we demonstrate the improved precisions of RT estimates within plexDIA and how this enables more accurate protein quantification. plexDIA has demonstrated multiplicative gains in throughput, and these gains may be substantially amplified by improving the multiplexing reagents, data acquisition and interpretation. We discuss future directions for advancing plexDIA, which include engineering optimized mass-tags for high-plexDIA, introducing isotopologous carriers, and developing algorithms that utilize the regular structures of plexDIA data to improve sensitivity, proteome coverage and quantitative accuracy. These advances in plexDIA will increase the throughput of functional proteomic assays, including quantifying protein conformations, turnover dynamics, modifications states and activities. The sensitivity of these assays will extend to single-cell analysis, thus enabling functional single-cell protein analysis. Abstract Figure