Abstract Two notable features have been identified in the SARS-CoV-2 genome: (1) the receptor binding domain of SARS-CoV-2; (2) a unique insertion of twelve nucleotide or four amino acids (PRRA) at the S1 and S2 boundary. For the first feature, the similar RBD identified in SARs-like virus from pangolin suggests the RBD in SARS-CoV-2 may already exist in animal host(s) before it transmitted into human. The left puzzle is the history and function of the insertion at S1/S2 boundary, which is uniquely identified in SARS-CoV-2. In this study, we identified two variants from the first Guangdong SARS-CoV-2 cell strain, with deletion mutations on polybasic cleavage site (PRRAR) and its flank sites. More extensive screening indicates the deletion at the flank sites of PRRAR could be detected in 3 of 68 clinical samples and half of 22 in vitro isolated viral strains. These data indicate (1) the deletion of QTQTN, at the flank of polybasic cleavage site, is likely benefit the SARS-CoV-2 replication or infection in vitro but under strong purification selection in vivo since it is rarely identified in clinical samples; (2) there could be a very efficient mechanism for deleting this region from viral genome as the variants losing 23585-23599 is commonly detected after two rounds of cell passage. The mechanistic explanation for this in vitro adaptation and in vivo purification processes (or reverse) that led to such genomic changes in SARS-CoV-2 requires further work. Nonetheless, this study has provided valuable clues to aid further investigation of spike protein function and virus evolution. The deletion mutation identified in vitro isolation should be also noted for current vaccine development.

Abstract The first SARS-CoV-2 variant of concern (VOC) to be designated was lineage B.1.1.7, later labelled by the World Health Organisation (WHO) as Alpha. Originating in early Autumn but discovered in December 2020, it spread rapidly and caused large waves of infections worldwide. The Alpha variant is notable for being defined by a long ancestral phylogenetic branch with an increased evolutionary rate, along which only two sequences have been sampled. Alpha genomes comprise a well-supported monophyletic clade within which the evolutionary rate is more typical of SARS-CoV-2. The Alpha epidemic continued to grow despite the continued restrictions on social mixing across the UK, and the imposition of new restrictions, in particular the English national lockdown in November 2020. While these interventions succeeded in reducing the absolute number of cases, the impact of these non-pharmaceutical interventions was predominantly to drive the decline of the SARS-CoV-2 lineages which preceded Alpha. We investigate the only two sampled sequences that fall on the branch ancestral to Alpha. We find that one is likely to be a true intermediate sequence, providing information about the order of mutational events that led to Alpha. We explore alternate hypotheses that can explain how Alpha acquired a large number of mutations yet remained largely unobserved in a region of high genomic surveillance: an under-sampled geographical location, a non-human animal population, or a chronically-infected individual. We conclude that the last hypothesis provides the best explanation of the observed behaviour and dynamics of the variant, although we find that the individual need not be immunocompromised, as persistently-infected immunocompetent hosts also display a higher within-host rate of evolution. Finally, we compare the ancestral branches and mutation profiles of other VOCs to each other, and identify that Delta appears to be an outlier both in terms of the genomic locations of its defining mutations, and its lack of rapid evolutionary rate on the ancestral branch. As new variants, such as Omicron, continue to evolve (potentially through similar mechanisms) it remains important to investigate the origins of other variants to identify ways to potentially disrupt their evolution and emergence.

Abstract B cells undergo rapid mutation and selection for antibody binding affinity when producing antibodies capable of neutralizing pathogens. This evolutionary process can be intermixed with migration between tissues, differentiation between cellular subsets, and switching between functional isotypes. B cell receptor (BCR) sequence data has the potential to elucidate important information about these processes. However, there is currently no robust, generalizable framework for making such inferences from BCR sequence data. To address this, we develop three parsimony-based summary statistics to characterize migration, differentiation, and isotype switching along B cell phylogenetic trees. We use simulations to demonstrate the effectiveness of this approach. We then use this framework to infer patterns of cellular differentiation and isotype switching from high throughput BCR sequence datasets obtained from patients in a study of HIV infection and a study of food allergy. These methods are implemented in the R package dowser , available at https://bitbucket.org/kleinstein/dowser . Author summary B cells produce high affinity antibodies through an evolutionary process of mutation and selection during adaptive immune responses. Migration between tissues, differentiation to cellular subtypes, and switching between different antibody isotypes can be important factors in shaping the role B cells play in response to infection, autoimmune disease, and allergies. B cell receptor (BCR) sequence data has the potential to elucidate important information about these processes. However, there is currently no robust, generalizable framework for making such inferences from BCR sequence data. Here, we develop three parsimony-based summary statistics to characterize migration, differentiation, and isotype switching along B cell phylogenetic trees. Using simulations, we confirm the effectiveness of our approach, as well as identify some caveats. We further use these summary statistics to investigate patterns of cellular differentiation in three HIV patients, and patterns of isotype switching in an individual with food allergies. Our methods are released in the R package dowser : https://bitbucket.org/kleinstein/dowser .

Abstract Poor efficacy of seasonal influenza virus vaccines is often attributed to pre-existing immunity interfering with the persistence and maturation of vaccine-induced B cell responses. 1 Consistent with this notion, no significant increase in somatic hypermutation (SHM) among circulating influenza-binding lineages was detected following seasonal vaccination in humans. 2 A more recent study showed that at least a subset of vaccine-induced B cell lineages are recruited into germinal centers (GCs) following vaccination, suggesting that affinity maturation of these lineages can occur. 3 Crucially, however, it has not been demonstrated whether these GC-engaged lineages actually accumulate additional SHM. Here, we address this point using a phylogenetic test of measurable evolution. We first validate this test through simulations and demonstrate measurable B cell evolution in known examples of affinity maturation such as the response to HIV infection. We then show that lineages in the blood are rarely measurably evolving following influenza vaccination, but that GC-engaged lineages - likely derived from memory B cells - are frequently measurably evolving. These findings confirm that seasonal influenza virus vaccination can stimulate additional SHM among responding B cell lineages.

Abstract More than 2 million SARS-CoV-2 genome sequences have been generated and shared since the start of the COVID-19 pandemic and constitute a vital information source that informs outbreak control, disease surveillance, and public health policy. The Pango dynamic nomenclature is a popular system for classifying and naming genetically-distinct lineages of SARS-CoV-2, including variants of concern, and is based on the analysis of complete or near-complete virus genomes. However, for several reasons, nucleotide sequences may be generated that cover only the spike gene of SARS-CoV-2. It is therefore important to understand how much information about Pango lineage status is contained in spike-only nucleotide sequences. Here we explore how Pango lineages might be reliably designated and assigned to spike-only nucleotide sequences. We survey the genetic diversity of such sequences, and investigate the information they contain about Pango lineage status. Although many lineages, including the main variants of concern, can be identified clearly using spike-only sequences, some spike-only sequences are shared among tens or hundreds of Pango lineages. To facilitate the classification of SARS-CoV-2 lineages using subgenomic sequences we introduce the notion of designating such sequences to a “lineage set”, which represents the range of Pango lineages that are consistent with the observed mutations in a given spike sequence. These data provide a foundation for the development of software tools that can assign newly-generated spike nucleotide sequences to Pango lineage sets.

In order to produce effective antibodies, B cells undergo rapid somatic hypermutation (SHM) and selection for binding affinity to antigen via a process called affinity maturation. The similarities between this process and evolution by natural selection have led many groups to use evolutionary and phylogenetic methods to characterize the development of immunological memory, vaccination, and other processes that depend on affinity maturation. However, these applications are limited by several features of affinity maturation that violate assumptions in standard phylogenetic models. Further, most phylogenetic models are designed to be applied to individual lineages comprising genetically diverse sequences, while B cell repertoires often consist of hundreds to thousands of separate low-diversity lineages. Here, we introduce a hierarchical phylogenetic framework that incorporates the unique features of SHM, and integrates information from all lineages in a repertoire to more precisely estimate model parameters. We demonstrate the power of this approach by characterizing previously un-described phenomena in affinity maturation. First, we find evidence consistent with age related changes in SHM hot- and cold-spot motifs. Second, we identify a consistent relationship between increased tree length and signs of increased negative selection, apparent in the repertoires of both healthy subjects and those undergoing active immune responses. This suggests that B cell lineages shift towards negative selection over time as a general feature of affinity maturation. Our study provides a framework for undertaking repertoire-wide phylogenetic testing of SHM hypotheses, and provides a new means of charactering the process of mutation and selection during affinity maturation.

Background: Zika virus (ZIKV) infections and suspected microcephaly cases have been recently reported in Angola, but no data are available on the origins, epidemiology, and diversity of the virus. Methods: Serum samples from 54 suspected ZIKV cases, 76 suspected microcephaly cases, and 24 mothers of infants with suspected microcephaly were received by the Angolan Ministry of Health. Computed tomographic brain imaging and serological assays (PRNT) were conducted on one microcephalic infant. All sera were tested for ZIKV by RT-qPCR. 349 samples from HIV+ patients and 336 samples from patients suspected of chikungunya virus or dengue virus infection were also tested. Portable sequencing was used to generate Angolan ZIKV genome sequences, including from a ZIKV+ neonate with microcephaly born in Portugal to an Angolan resident. Genetic and mobility data were analysed to investigate the date of introduction and geographic origin of ZIKV in Angola. Findings: Four autochthonous cases were ZIKV positive via RT-qPCR, with all positive samples collected between December 2016 and June 2017. Viral genomes were generated for two of these cases, and from the neonate with microcephaly identified in Portugal. Genetic analyses and other data indicate that ZIKV was introduced to Angola from Brazil between July 2015 and June 2016. This introduction likely initiated local ZIKV circulation in Angola that continued until June 2017. The scanned microcephaly case showed brain abnormalities consistent with congenital Zika syndrome and serological evidence for maternal ZIKV infection. Interpretation: Our analyses confirm the autochthonous transmission of the ZIKV Asian lineage in continental Africa. Conducting ZIKV surveillance throughout Africa is critical in the light of presented evidence for autochthonous ZIKV transmission in Angola, and associated microcephaly cases. Funding: Royal Society, Wellcome Trust, CNPq, CAPES, ERC, Oxford Martin School, Global Challenges Research Fund, Africa Oxford, and John Fell Fund.

Computational analyses of pathogen genomes are increasingly used to unravel the dispersal history and transmission dynamics of epidemics. Here, we show how to go beyond historical reconstructions and use spatially-explicit phylogeographic and phylodynamic approaches to formally test epidemiological hypotheses. We illustrate our approach by focusing on the West Nile virus (WNV) spread in North America that has been responsible for substantial impacts on public, veterinary, and wildlife health. WNV isolates have been sampled at various times and locations across North America since its introduction to New York twenty years ago. We exploit this genetic data repository to demonstrate that factors hypothesised to affect viral dispersal and demography can be formally tested. Specifically, we detail and apply an analytical workflow consisting of state-of-the art methods that we further improve to test the impact of environmental factors on the dispersal locations, velocity, and frequency of viral lineages, as well as on the genetic diversity of the viral population through time. We find that WNV lineages tend to disperse faster in areas with higher temperatures and we identify temporal variation in temperature as a main predictor of viral genetic diversity through time. Using a simulation procedure, we find no evidence that viral lineages preferentially circulate within the same migratory bird flyway, suggesting a substantial role for non-migratory birds or mosquito dispersal along the longitudinal gradient. Finally, we also separately apply our testing approaches on the three WNV genotypes that circulated in North America in order to understand and compare their dispersal ability. Our study demonstrates that the development and application of statistical approaches, coupled with comprehensive pathogen genomic data, can address epidemiological questions that might otherwise be difficult or impractically expensive to answer.

Phylogenetic methods have shown promise in understanding the development of broadly neutralizing antibody lineages (bNAbs). However, the mutational process that generates these lineages—somatic hypermutation (SHM)—is biased by hotspot motifs, which violates important assumptions in most phylogenetic substitution models. Here, we develop a modified GY94-type substitution model that partially accounts for this context-dependency while preserving independence of sites during calculation. This model shows a substantially better fit to three well-characterized bNAb lineages than the standard GY94 model. We show through simulations that accounting for hotspot motifs can lead to reduced bias of other substitution parameters, and more accurate ancestral state reconstructions. We also demonstrate how our model can be used to test hypotheses concerning the roles of different hotspot and coldspot motifs in the evolution of B-cell lineages. Further, we explore the consequences of the idea that the number of hotspot motifs—and perhaps the mutation rate in general—is expected to decay over time in individual bNAb lineages.

Oropouche virus (OROV) is responsible for outbreaks of Oropouche fever in parts of South America. We recently identified and isolated OROV from a febrile Ecuadorian patient, however, a previously published rRT-PCR assay did not detect OROV in the patient sample. A primer mismatch to the Ecuadorian OROV lineage was identified from metagenomic sequencing data. We report the optimisation of an rRT-PCR assay for the Ecuadorian OROV lineage, which subsequently identified a further five cases in a cohort of 196 febrile patients. We isolated OROV via cell culture and developed an algorithmically-designed primer set for whole-genome amplification of the virus. Metagenomic sequencing of the patient samples provided OROV genome coverage ranging from 68 - 99%. The additional cases formed a single phylogenetic cluster together with the initial case. OROV should be considered as a differential diagnosis for Ecuadorian patients with febrile illness to avoid mis-diagnosis with other circulating pathogens.