Alzheimer's disease is an increasingly prevalent neurodegenerative disorder whose pathogenesis has been associated with aggregation of the amyloid-β peptide (Aβ42). Recent studies have revealed that once Aβ42 fibrils are generated, their surfaces effectively catalyze the formation of neurotoxic oligomers. Here we show that a molecular chaperone, a human Brichos domain, can specifically inhibit this catalytic cycle and limit human Aβ42 toxicity. We demonstrate in vitro that Brichos achieves this inhibition by binding to the surfaces of fibrils, thereby redirecting the aggregation reaction to a pathway that involves minimal formation of toxic oligomeric intermediates. We verify that this mechanism occurs in living mouse brain tissue by cytotoxicity and electrophysiology experiments. These results reveal that molecular chaperones can help maintain protein homeostasis by selectively suppressing critical microscopic steps within the complex reaction pathways responsible for the toxic effects of protein misfolding and aggregation.

Deposits of amyloid-β (Aβ) in the brains of rodents can be analysed by invasive intravital microscopy on a submillimetre scale, or via whole-brain images from modalities lacking the resolution or molecular specificity to accurately characterize Aβ pathologies. Here we show that large-field multifocal illumination fluorescence microscopy and panoramic volumetric multispectral optoacoustic tomography can be combined to longitudinally assess Aβ deposits in transgenic mouse models of Alzheimer's disease. We used fluorescent Aβ-targeted probes (the luminescent conjugated oligothiophene HS-169 and the oxazine-derivative AOI987) to transcranially detect Aβ deposits in the cortex of APP/PS1 and arcAβ mice with single-plaque resolution (8 μm) and across the whole brain (including the hippocampus and the thalamus, which are inaccessible by conventional intravital microscopy) at sub-150 μm resolutions. Two-photon microscopy, light-sheet microscopy and immunohistochemistry of brain-tissue sections confirmed the specificity and regional distributions of the deposits. High-resolution multiscale optical and optoacoustic imaging of Aβ deposits across the entire brain in rodents thus facilitates the in vivo study of Aβ accumulation by brain region and by animal age and strain.

Abstract The maturation of liquid-like protein condensates into amyloid fibrils has been associated with neurodegenerative diseases. Here, we analyze the amyloid formation mediated by condensation of the low-complexity domain of hnRNPA1, a protein involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). We show that phase separation and fibrillation are connected but distinct processes which are independently mediated by different regions of the protein sequence. By monitoring the spatial and temporal evolution of amyloid formation we demonstrate that the formation of fibrils does not occur homogeneously inside the droplets but is promoted at the interface of the condensates. Consistently, we further show that coating the interface of the droplets with surfactant molecules inhibits fibril formation. Our results indicate that the interface of biomolecular condensates can act as an important catalyst for fibril formation, and therefore could represent a possible therapeutic target against the formation of aberrant amyloids mediated by condensation.

Viscosity of protein solutions is a critical product quality attribute for protein therapeutics such as monoclonal antibodies. Here we introduce a portable single-use analytical chip-based viscometer for determining the viscosity of protein solutions using low sample volumes of 10 μL. Through the combined use of a microfluidic viscometer, a smartphone camera for image capture, and an automated data processing algorithm for the calculation of the viscosity of fluids, we enable measurement of viscosity of multiple samples in parallel. We first validate the viscometer using glycerol–water mixtures and subsequently demonstrate the ability to perform rapid characterization of viscosity in four different monoclonal antibody formulations in a broad concentration (1 to 320 mg/mL) and viscosity (1 to 600 cP) range, showing excellent agreement with values obtained by a conventional cone–plate rheometer. Not only does the platform offer benefits of viscosity measurements using minimal sample volumes, but enables higher throughput compared to gold-standard methodologies owing to multiplexing of the measurement and single-use characteristics of the viscometer, thus showing great promise in developability studies. Additionally, as our platform has the capability of performing viscosity measurements at the point of sample collection, it offers the opportunity to employ viscosity measurement as an in situ quality control of therapeutic proteins and antibodies.

The abnormal deposition of amyloid-beta proteins in the brain is one of the major histopathological hallmarks of Alzheimers′ disease. Currently available intravital microscopy techniques for high-resolution plaque visualization commonly involve highly invasive procedures and are limited to a small field-of-view within the rodent brain. Here, we report the transcranial detection of amyloid-beta deposits at the whole brain scale with 20 μm resolution in APP/PS1 and arcAβ mouse models of Alzheimer′s disease amyloidosis using a large-field multifocal illumination (LMI) fluorescence microscopy technique. Highly sensitive and specific detection of amyloid-beta deposits at a single plaque level in APP/PS1 and arcAβ mice was facilitated using luminescent conjugated oligothiophene HS-169. Immunohistochemical staining with HS-169, anti-Aβ antibody 6E10, and conformation antibodies OC (fibrillar) of brain tissue sections further showed that HS-169 resolved compact parenchymal and vessel-associated amyloid deposits. The novel imaging platform offers new prospects for in vivo studies into Alzheimer′s disease mechanisms in animal models as well as longitudinal monitoring of therapeutic responses at a single plaque level.

Understanding the mechanism of action of compounds capable of inhibiting protein aggregation is critical to the development of potential therapeutics against protein misfolding diseases. A fundamental challenge for progress is the range of possible target species and the disparate timescales involved, since the aggregating proteins are simultaneously the reactants, products, intermediates and catalysts of the reaction. It is a complex problem, therefore, to choose the states of the aggregating proteins that should be bound by the compounds to achieve the most potent inhibition. We present here a comprehensive kinetic theory of protein aggregation inhibition which reveals the fundamental thermodynamic and kinetic signatures characterising effective inhibitors by identifying quantitative relationships between the aggregation and binding rate constants. These results provide general physical laws to guide the design and optimisation of protein aggregation inhibitors.

Abstract Biomolecular condensates require suitable material properties to properly carry out their function. Yet, modulators that affect the material properties of condensates have remained largely unexplored. Here we apply Differential Dynamic Microscopy (DDM) to probe the material properties of an in vitro model of processing bodies (P-bodies) consisting of condensates formed by the DEAD-box ATPase Dhh1 in the presence of ATP and RNA. DDM allows us to measure the viscosity of liquid droplets and to distinguish between liquid-like and gel- or glass-like condensates. By applying this single-droplet technique we show that condensates within the same population exhibit a distribution of material properties, which can be drastically affected by several modulators such as the low-complexity domains (LCDs) of the protein, the protein/RNA ratio, the type of RNA as well as the enzymatic activity. In particular, we show that structured RNA leads to a large fraction of dynamically arrested condensates with respect to unstructured polyuridylic acid (polyU), emphasizing the role of RNA structure in condensate dynamics. We further demonstrate that the ageing of the condensates and the formation of gel or glass-like structures is reduced by promoting the enzymatic ATPase activity of Dhh1 and the rate of droplet formation and dissolution. Our study shows that not only the reversible formation and dissolution of condensates but also their material properties are regulated on several levels, and that biochemical activity and material turnover can be important to maintain fluid-like properties over time.

ABSTRACT An increasing number of cases where amyloids of different proteins are found in the same patient are being reported. This observation complicates diagnosis and clinical intervention. Amyloids of the amyloid-β peptide or the protein α-synuclein are traditionally considered hallmarks of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, respectively. However, the co-occurrence of amyloids of these proteins has also been reported in patients diagnosed with either disease. Here, we show that soluble species containing amyloid-β can induce the aggregation of α-synuclein. Fibrils formed under these conditions are solely composed of α-synuclein to which amyloid-β can be found associated, but not as part of the core of the fibrils. Importantly, by global kinetic analysis, we found that the aggregation of α-synuclein under these conditions occurs via heterogeneous primary nucleation, triggered by soluble aggregates containing amyloid-β.

Protein denaturation and aggregation resulting from the effects of interfacial stress, often enhanced by flow and shear stress, pose significant challenges in the production of therapeutic proteins and monoclonal antibodies. The influence of flow on protein stability is closely intertwined with interfacial effects. In this study, we have developed a microfluidic device capable of exposing low volume (< 320 µL) protein solutions to highly uniform shear. To disentangle the synergistic impact of flow and interfaces on protein aggregation, we fabricated two devices composed of different materials, namely poly(methyl methacrylate) (PMMA) and stainless steel. Upon application of shear, we observed formation of protein particles in the micron-size range. Notably, The number of particles generated in the steel devices was ∼ 3.5 fold lower than in the PMMA device, hinting at an interface-mediated effect. With increasing the protein concentration from 1 to 50 mg/mL we observed a saturation in the amount of aggregates, further confirming the key role of solid-liquid interfaces in inducing particle formation. Introduction of non-ionic surfactants prevented protein aggregation, even at the highest tested protein concentration and low surfactant concentrations of 0.05 mg/mL. Overall, our findings corroborate the synergistic impact of shear and interface effects on protein aggregation. The device developed in this study offers a small-scale platform for assessing the stability of antibody formulations throughout various stages of the development and manufacturing process.