Douglas Higgs and colleagues functionally test the α-globin super-enhancer in mice by genetically deleting its constituent enhancers. They find that the individual regulatory elements seem to act independently and in an additive way with respect to hematological phenotype, gene expression, and chromatin structure and conformation. Many genes determining cell identity are regulated by clusters of Mediator-bound enhancer elements collectively referred to as super-enhancers. These super-enhancers have been proposed to manifest higher-order properties important in development and disease. Here we report a comprehensive functional dissection of one of the strongest putative super-enhancers in erythroid cells. By generating a series of mouse models, deleting each of the five regulatory elements of the α-globin super-enhancer individually and in informative combinations, we demonstrate that each constituent enhancer seems to act independently and in an additive fashion with respect to hematological phenotype, gene expression, chromatin structure and chromosome conformation, without clear evidence of synergistic or higher-order effects. Our study highlights the importance of functional genetic analyses for the identification of new concepts in transcriptional regulation.

ABSTRACT DNA folding within nuclei is a highly ordered process, with implications for gene regulation and development. An array of chromosome conformation capture (3C) methods have been developed to investigate how DNA is packaged within nuclei and to interrogate specific interactions. While these methods use different approaches to examine target loci (many-versus-all) or the entire genome (all-versus-all), they all rely on the core principle of endonuclease digestion and proximity-based ligation to re-arrange genomic order to reflect the three-dimensional nuclear conformation. This sequence reorganization creates novel chimeric DNA fragments which require specialist bioinformatic tools to analyze and visualize. Despite this need for specialist bioinformatic skills, the core biological importance of genome folding has seen widespread methodological uptake. To service the needs of experimentalists using the many-versus-all Capture-C family of methods we have developed CaptureCompendium; a toolkit of software to simplify the design, analysis and presentation of 3C experiments.

ABSTRACT Enhancer-mediated gene activation generally requires physical proximity between enhancers and their target gene promoters. However, the molecular mechanisms by which interactions between enhancers and promoters are formed are not well understood. Here, we investigate the function of the Mediator complex in the regulation of enhancer-promoter interactions, by combining rapid protein depletion and high-resolution MNase-based chromosome conformation capture approaches. We show that depletion of Mediator leads to reduced enhancer-promoter interaction frequencies, which are associated with a strong decrease in gene expression. In addition, we find increased interactions between CTCF-binding sites upon Mediator depletion. These changes in chromatin architecture are associated with a re-distribution of the Cohesin complex on chromatin and a reduction in Cohesin occupancy specifically at enhancers. Our results indicate that enhancer-promoter interactions are dependent on an interplay between the Mediator and Cohesin complexes and provide new insights into the molecular mechanisms by which communication between enhancers and promoters is regulated.

Abstract Transcriptional enhancers regulate gene expression in a developmental-stage and cell-specific manner. They were originally defined as individual regulatory elements that activate expression regardless of distance and orientation to their cognate genes. Genome-wide studies have shown that the mammalian enhancer landscape is much more complex, with different classes of individual enhancers and clusters of enhancer-like elements combining in additive, synergistic and redundant manners, possibly acting as single, integrated regulatory elements. These so-called super-enhancers are largely defined as clusters of enhancer-like elements which recruit particularly high levels of Mediator and often drive high levels of expression of key lineage-specific genes. Here, we analysed 78 erythroid-specific super-enhancers and showed that, as units, they preferentially interact in a directional manner, to drive expression of their cognate genes. Using the well characterised α-globin super-enhancer, we show that inverting this entire structure severely downregulates α-globin expression and activates flanking genes 5’ of the super-enhancer. Our detailed genetic dissection of the α-globin locus clearly attributes the cluster’s functional directionality to its sequence orientation, demonstrating that, unlike regular enhancers, super-enhancers act in an orientation-dependent manner. Together, these findings identify a novel emergent property of super-enhancers and revise current models by which enhancers are thought to contact and activate their cognate genes.

Facilitates chromatin transcription (FACT) is a histone chaperone that supports transcription through chromatin in vitro, but its functional roles in vivo remain unclear. Here, we analyze the in vivo functions of FACT with the use of multi-omics analysis after rapid FACT depletion from human cells. We show that FACT depletion destabilizes chromatin and leads to transcriptional defects, including defective promoter-proximal pausing and elongation, and increased premature termination of RNA polymerase II. Unexpectedly, our analysis revealed that promoter-proximal pausing depends not only on the negative elongation factor (NELF) but also on the +1 nucleosome, which is maintained by FACT.

Abstract Mammalian gene expression patterns are controlled by regulatory elements, which interact within Topologically Associating Domains (TADs). The relationship between activation of regulatory elements, formation of structural chromatin interactions and gene expression during development is unclear. We developed Tiled-C, a low-input Chromosome Conformation Capture (3C) approach, to study chromatin architecture at high spatial and temporal resolution through in vivo mouse erythroid differentiation. Integrated analysis of matched chromatin accessibility and single-cell expression data shows that regulatory elements gradually become accessible within pre-existing TADs during early differentiation. This is followed by structural re-organization within the TAD and formation of specific contacts between enhancers and promoters. In contrast to previous reports, our high-resolution data show that these enhancer-promoter interactions are not established prior to gene expression, but formed gradually during differentiation, concomitant with progressive upregulation of gene activity. Together, these results provide new insight into the close, interdependent relationship between chromatin architecture and gene regulation during development.

ABSTRACT Enhancers and promoters predominantly interact within large-scale topologically associating domains (TADs), which are formed by loop extrusion mediated by cohesin and CTCF. However, it is unclear whether complex chromatin structures exist at sub-kilobase-scale and to what extent fine-scale regulatory interactions depend on loop extrusion. To address these questions, we present an MNase-based chromosome conformation capture (3C) approach, which has enabled us to generate the most detailed local interaction data to date and precisely investigate the effects of cohesin and CTCF depletion on chromatin architecture. Our data reveal that cis -regulatory elements have distinct internal nano-scale structures, within which local insulation is dependent on CTCF, but which are independent of cohesin. In contrast, we find that depletion of cohesin causes a subtle reduction in longer-range enhancer-promoter interactions and that CTCF depletion can cause rewiring of regulatory contacts. Together, our data show that loop extrusion is not essential for enhancer-promoter interactions, but contributes to their robustness and specificity and to precise regulation of gene expression.

Abstract The transcription factor RUNX1 is a critical regulator of developmental hematopoiesis and is frequently disrupted in leukemia. Runx1 is a large, complex gene that is expressed from two alternative promoters under the spatiotemporal control of multiple hematopoietic enhancers. To dissect the dynamic regulation of Runx1 in hematopoietic development, we analyzed its three-dimensional chromatin conformation in mouse embryonic stem cell (ESC) differentiation cultures. Runx1 resides in a 1.1 Mb topologically associating domain (TAD) demarcated by convergent CTCF motifs. As ESCs differentiate to mesoderm, chromatin accessibility, Runx1 enhancer-promoter (E-P) interactions, and CTCF-CTCF interactions increased in the TAD, along with initiation of Runx1 expression from the P2 promoter. Differentiation to hematopoietic progenitor cells was associated with the formation of tissue-specific sub-TADs over Runx1 , a shift in E-P interactions, P1 promoter demethylation, and robust expression from both Runx1 promoters. Deletions of promoter-proximal CTCF sites at the sub-TAD boundaries had no obvious effects on E-P interactions but led to partial loss of domain structure, mildly affected gene expression, and delayed hematopoietic development. Together, our analyses of gene regulation at a large multi-promoter developmental gene revealed that dynamic sub-TAD chromatin boundaries play a role in establishing TAD structure and coordinated gene expression.

ABSTRACT Senescence —the endpoint of replicative lifespan for normal cells— is established via a complex sequence of molecular events. One such event is the dramatic reorganization of CTCF into senescence-induced clusters (SICCs). However, the molecular determinants, genomic consequences, and functional purpose of SICCs remained unknown. Here, we combine functional assays, super-resolution imaging, and 3D genomics with computational modelling to dissect SICC emergence. We establish that the competition between CTCF-bound and non-bound loci dictates clustering propensity. Upon senescence entry, cells repurpose SRRM2 —a key component of nuclear speckles— and BANF1 —a ‘molecular glue’ for chromosomes— to cluster CTCF and rewire genome architecture. This CTCF-centric reorganization in reference to nuclear speckles functionally sustains the senescence splicing program, as SICC disruption fully reverts alternative splicing patterns. We therefore uncover a new paradigm, whereby cells translate changes in nuclear biochemistry into architectural changes directing splicing choices so as to commit to the fate of senescence. GRAPHICAL ABSTRACT HIGHLIGHTS HMGB2-bound loci compete with CTCF-bound ones for nuclear speckle association Senescent cells repurpose SRRM2 and BANF1 to cluster CTCF on speckles BANF1 is essential, but not sufficient for CTCF clustering The SRRM2 RNA-binding domain directs CTCF clustering SICCs rewire chromatin positioning to sustain the senescence splicing program

A variety of self-interacting domains, defined at different levels of resolution, have been described in mammalian genomes. These include Chromatin Compartments (A and B), Topologically Associated Domains (TADs), contact domains, sub-TADs, insulated neighbourhoods and frequently interacting regions (FIREs). Whereas many studies have found the organisation of self-interacting domains to be conserved across cell types, some do form in a lineage-specific manner. However, it is not clear to what degree such tissue-specific structures result from processes related to gene activity such as enhancer-promoter interactions or whether they form earlier during lineage commitment and are therefore likely to be prerequisite for promoting gene expression. To examine these models of genome organisation in detail, we used a combination of high-resolution chromosome conformation capture, a newly-developed form of quantitative fluorescence in-situ hybridisation and super-resolution imaging to study a 70 kb self-interacting domain containing the mouse α-globin locus. To understand how this self-interacting domain is established, we studied the region when the genes are inactive and during erythroid differentiation when the genes are progressively switched on. In contrast to many current models of long-range gene regulation, we show that an erythroid-specific, decompacted self-interacting domain, delimited by convergent CTCF/cohesin binding sites, forms prior to the onset of robust gene expression. Using previously established mouse models we show that formation of the self-interacting domain does not rely on interactions between the α-globin genes and their enhancers. As there are also no tissue-specific changes in CTCF binding, then formation of the domain may simply depend on the presence of activated lineage-specific cis-elements driving a transcription-independent mechanism for opening chromatin throughout the 70 kb region to create a permissive environment for gene expression. These findings are consistent with a model of loop-extrusion in which all segments of chromatin, within a region delimited by CTCF boundary elements, can contact each other. Our findings suggest that activation of tissue-specific element(s) within such a self-interacting region is sufficient to influence all chromatin within the domain.