Recent advances in single-cell technologies have enabled high-throughput molecular profiling of cells across modalities and locations. Single-cell transcriptomics data can now be complemented by chromatin accessibility, surface protein expression, adaptive immune receptor repertoire profiling and spatial information. The increasing availability of single-cell data across modalities has motivated the development of novel computational methods to help analysts derive biological insights. As the field grows, it becomes increasingly difficult to navigate the vast landscape of tools and analysis steps. Here, we summarize independent benchmarking studies of unimodal and multimodal single-cell analysis across modalities to suggest comprehensive best-practice workflows for the most common analysis steps. Where independent benchmarks are not available, we review and contrast popular methods. Our article serves as an entry point for novices in the field of single-cell (multi-)omic analysis and guides advanced users to the most recent best practices.

The rapid growth of high-throughput single-cell and single-nucleus RNA sequencing technologies has produced a wealth of data over the past few years. The available technologies continue to evolve and experiments continue to increase in both number and scale. The size, volume, and distinctive characteristics of these data necessitate the development of new software and associated computational methods to accurately and efficiently quantify single-cell and single-nucleus RNA-seq data into count matrices that constitute the input to downstream analyses. We introduce the alevin-fry framework for quantifying single-cell and single-nucleus RNA-seq data. Despite being faster and more memory frugal than other accurate and scalable quantification approaches, alevin-fry does not suffer from the false positive expression or memory scalability issues that are exhibited by other lightweight tools. We demonstrate how alevin-fry can be effectively used to quantify single-cell and single-nucleus RNA-seq data, and also how the spliced and unspliced molecule quantification required as input for RNA velocity analyses can be seamlessly extracted from the same pre-processed data used to generate regular gene expression count matrices.

Recently, a new modification has been proposed by Hjörleifsson and Sullivan et al. to the model used to classify the splicing status of reads (as spliced (mature), unspliced (nascent), or ambiguous) in single-cell and single-nucleus RNA-seq data. Here, we evaluate both the theoretical basis and practical implementation of the proposed method. The proposed method is highly-conservative, and therefore, unlikely to mischaracterize reads as spliced (mature) or unspliced (nascent) when they are not. However, we find that it leaves a large fraction of reads classified as ambiguous, and, in practice, allocates these ambiguous reads in an all-or-nothing manner, and differently between single-cell and single-nucleus RNA-seq data. Further, as implemented in practice, the ambiguous classification is implicit and based on the index against which the reads are mapped, which leads to several drawbacks compared to methods that consider both spliced (mature) and unspliced (nascent) mapping targets simultaneously - for example, the ability to use confidently assigned reads to rescue ambiguous reads based on shared UMIs and gene targets. Nonetheless, we show that these conservative assignment rules can be obtained directly in existing approaches simply by altering the set of targets that are indexed. To this end, we introduce the spliceu reference and show that its use with alevin-fry recapitulates the more conservative proposed classification. We also observe that, on experimental data, and under the proposed allocation rules for ambiguous UMIs, the difference between the proposed classification scheme and existing conventions appears much smaller than previously reported. We demonstrate the use of the new piscem index for mapping simultaneously against spliced (mature) and unspliced (nascent) targets, allowing classification against the full nascent and mature transcriptome in human or mouse in <3GB of memory. Finally, we discuss the potential of incorporating probabilistic evidence into the inference of splicing status, and suggest that it may provide benefits beyond what can be obtained from discrete classification of UMIs as splicing-ambiguous.

The alevin-fry ecosystem provides a robust and growing suite of programs for single-cell data processing. However, as new single-cell technologies are introduced, as the community continues to adjust best practices for data processing, and as the alevin-fry ecosystem itself expands and grows, it is becoming increasingly important to manage the complexity of alevin-fry â€™s single-cell preprocessing workflows while retaining the performance and flexibility that make these tools enticing. We introduce simpleaf , a program that simplifies the processing of single-cell data using tools from the alevin-fry ecosystem, and adds new functionality and capabilities, while retaining the flexibility and performance of the underlying tools.Simpleaf is written in Rust and released under a BSD 3-Clause license. It is freely available from its GitHub repository https://github.com/COMBINE-lab/simpleaf , and via bioconda. Documentation for simpleaf is available at https://simpleaf.readthedocs.io/en/latest/ and tutorials for simpleaf are being developed that can be accessed at https://combine-lab.github.io/alevin-fry-tutorials .

Abstract Motivation Short-read single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) has been used to study cellular heterogeneity, cellular fate, and transcriptional dynamics. Modeling splicing dynamics in scRNA-seq data is challenging, with inherent difficulty in even the seemingly straightforward task of elucidating the splicing status of the molecules from which sequenced fragments are drawn. This difficulty arises, in part, from the limited read length and positional biases, which substantially reduce the specificity of the sequenced fragments. As a result, the splicing status of many reads in scRNA-seq is ambiguous because of a lack of definitive evidence. We are therefore in need of methods that can recover the splicing status of ambiguous reads which, in turn, can lead to more accuracy and confidence in downstream analyses. Results We develop Forseti , a predictive model to probabilistically assign a splicing status to scRNA-seq reads. Our model has two key components. First, we train a binding affinity model to assign a probability that a given transcriptomic site is used in fragment generation. Second, we fit a robust fragment length distribution model that generalizes well across datasets deriving from different species and tissue types. Forseti combines these two trained models to predict the splicing status of the molecule of origin of reads by scoring putative fragments that associate each alignment of sequenced reads with proximate potential priming sites. Using both simulated and experimental data, we show that our model can precisely predict the splicing status of reads and identify the true gene origin of multi-gene mapped reads. Availability Forseti and the code used for producing the results are available at https://github.com/COMBINE-lab/forseti under a BSD 3-clause license.

Abstract Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) provides unprecedented insights into cellular heterogeneity. Although scRNA-seq reads from most prevalent and popular tagged-end protocols are expected to arise from the 3′ end of polyadenylated RNAs, recent studies have shown that “off-target” reads can constitute a substantial portion of the read population. in this work, we introduced scCensus , a comprehensive analysis workflow for systematically evaluating and categorizing off-target reads in scRNA-seq. We applied scCensus to seven scRNA-seq datasets. Our analysis of intergenic reads shows that these off-target reads contain information about chromatin structure and can be used to identify similar cells across modalities. Our analysis of antisense reads suggests that these reads can be used to improve gene detection and capture interesting transcriptional activities like antisense transcription. Furthermore, using splice-aware quantification, we find that spliced and unspliced reads provide distinct information about cell clusters and biomarkers, suggesting the utility of integrating signals from reads with different splicing statuses. Overall, our results suggest that off-target scRNA-seq reads contain underappreciated information about various transcriptional activities. These observations about yet-unexploited information in existing scRNA-seq data will help guide and motivate the community to improve current algorithms and analysis methods, and to develop novel approaches that utilize off-target reads to extend the reach and accuracy of single-cell data analysis pipelines. Data Availability The scripts for reproducing the results are available at https://github.com/COMBINE-lab/sc-census . Supplementary files can be found at https://doi.org/10.5281/zenodo.10520670 .

Although transcriptomics data is typically used to analyse mature spliced mRNA, recent attention has focused on jointly investigating spliced and unspliced (or precursor-) mRNA, which can be used to study gene regulation and changes in gene expression production. Nonetheless, most methods for spliced/unspliced inference (such as RNA velocity tools) focus on individual samples, and rarely allow comparisons between groups of samples (e.g., healthy vs. diseased). Furthermore, this kind of inference is challenging, because spliced and unspliced mRNA abundance is characterized by a high degree of quantification uncertainty, due to the prevalence of multi-mapping reads, i.e., reads compatible with multiple transcripts (or genes), and/or with both their spliced and unspliced versions.Here, we present DifferentialRegulation, a Bayesian hierarchical method to discover changes between experimental conditions with respect to the relative abundance of unspliced mRNA (over the total mRNA). We model the quantification uncertainty via a latent variable approach, where reads are allocated to their gene/transcript of origin, and to the respective splice version. We designed several benchmarks where our approach shows good performance, in terms of sensitivity and error control, versus state-of-the-art competitors. Importantly, our tool is flexible, and works with both bulk and single-cell RNA-sequencing data.DifferentialRegulation is distributed as a Bioconductor R package.