The gene knockdown activity of small interfering RNA (siRNA) has led to their use as target validation tools and as potential therapeutics for a variety of diseases. The delivery of these double-stranded RNA macromolecules has proven to be challenging, however, and in many cases, is a barrier to their deployment. Here we report the development of a new diblock copolymer family that was designed to enhance the systemic and intracellular delivery of siRNA. These diblock copolymers were synthesized using the controlled reversible addition fragmentation chain transfer polymerization (RAFT) method and are composed of a positively-charged block of dimethylaminoethyl methacrylate (DMAEMA) to mediate siRNA condensation, and a second endosomal-releasing block composed of DMAEMA and propylacrylic acid (PAA) in roughly equimolar ratios, together with butyl methacylate (BMA). A related series of diblock compositions were characterized, with the cationic block kept constant, and with the ratio of DMAEMA and PAA to BMA varied. These carriers became sharply hemolytic at endosomal pH regimes, with increasing hemolytic activity seen as the percentage of BMA in the second block was systematically increased. The diblock copolymers condensed siRNA into 80–250 nm particles with slightly positive Zeta potentials. SiRNA-mediated knockdown of a model protein, namely glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), in HeLa cells generally followed the hemolytic activity trends, with the most hydrophobic second block (highest BMA content) exhibiting the best knockdown. This pH-responsive carrier designed to mediate endosomal release shows significant promise for the intracellular delivery of siRNA.

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this barrier, a number of synthetic drug carriers have been engineered to actively disrupt the endosomal membrane and deliver cargo into the cytoplasm. Here, we describe the hemolysis assay, which can be used as rapid, high-throughput screen for the cytocompatibility and endosomolytic activity of intracellular drug delivery systems. In the hemolysis assay, human red blood cells and test materials are co-incubated in buffers at defined pHs that mimic extracellular, early endosomal, and late endo-lysosomal environments. Following a centrifugation step to pellet intact red blood cells, the amount of hemoglobin released into the medium is spectrophotometrically measured (405 nm for best dynamic range). The percent red blood cell disruption is then quantified relative to positive control samples lysed with a detergent. In this model system the erythrocyte membrane serves as a surrogate for the lipid bilayer membrane that enclose endo-lysosomal vesicles. The desired result is negligible hemolysis at physiologic pH (7.4) and robust hemolysis in the endo-lysosomal pH range from approximately pH 5-6.8.

Abstract Impaired skin healing and progression into chronic wounds is a prevalent and growing medical problem. Porous, resorbable biomaterials can be used as temporary substrates placed into skin defects to support cell infiltration, neo-tissue formation, and remodeling of nonhealing wounds. Naturally-derived biomaterials have promising healing benefits, but their low mechanical properties and exuberant costs limit their performance and use. Synthetic materials can be affordably manufactured and tuned across a broader range of physiochemical properties, but opportunities remain for tailoring them for ideal host immune and regenerative responses. Polyesters are the most clinically-tested class of synthetic biomaterials, but their hydrolysis releases acidic degradation products that can cause autocatalytic degradation processes that are poorly controlled and are not tied to cellular or other biologic activities. Here, we systemically explored a series of ROS-degradable polythioketal (PTK) urethane (UR) foams with varied hydrophilicity as an alternative class of synthetic biomaterials for wound healing. It was found that the most hydrophilic PTK- UR variant, which had 7 ethylene glycol (EG7) repeats flanking each side of each thioketal bond, had the highest ROS reactivity of the PTK-URs tested. In an in vivo porcine excisional skin wound healing model, hydrophilic EG7 PTK-UR foams more effectively promoted tissue integration, ECM deposition, and re- epithelialization of full-thickness skin wound compared to more hydrophobic PTK-UR variants. Resolution of type 1 inflammation and lower foreign body response to scaffold remnants was also observed for EG7 versus more hydrophobic PTK-UR scaffolds. Finally, porcine wound healing studies showed that EG7 PTK-UR foams had similar wound healing response to a collagen-based clinical gold standard product, Integra Bilayer Wound Matrix (BWM), while outperforming polyester UR foam-based NovoSorb Biodegradable Temporizing Matrix (BTM) with respect to increased ECM production, vascularization, and biomaterial-associated immune phenotype. In sum, PTK-UR foams warrant further development toward a new class of synthetic biomaterial foams for skin wound healing applications.

Fetal growth restriction (FGR) significantly contributes to neonatal and perinatal morbidity and mortality. Currently, there are no effective treatment options for FGR during pregnancy. We have developed a nanoparticle gene therapy targeting the placenta to increase expression of human insulin-like growth factor 1 ( hIGF-1 ) to correct fetal growth trajectories. Using the maternal nutrient restriction (MNR) guinea pig model of FGR, an ultrasound-guided, intra-placental injection of non-viral, polymer-based nanoparticle gene therapy containing plasmid with the hIGF-1 gene and placenta-specific Cyp19a1 promotor was administered at mid-pregnancy. Sustained hIGF-1 expression was confirmed in the placenta five days after treatment. Whilst gene therapy treatment did not change fetal weight, circulating fetal glucose concentration were 33-67% higher. This was associated with increased expression of glucose and amino acid transporters in the placenta. Additionally, nanoparticle gene therapy treatment increased the fetal capillary volume density in the placenta, and reduced interhaemal distance between maternal and fetal circulation. Overall, our findings, that gene therapy treatment results in changes to glucose transporter expression and increases fetal glucose concentrations within a short time period, highlights the translational potential this treatment could have in correcting impaired placental nutrient transport in human pregnancies complicated by FGR.

Summary paragraph Chronic inflammation underlies the onset, progression and associated pain of numerous diseases.( 1 ) Current anti-inflammatory treatments administered systemically are associated with moderate-to-severe side effects, while locally administered drugs have short-lived efficacy, and neither approach successfully modifies the underlying causality of disease.( 2 ) We report a new way to locally modulate inflammation by fusing the enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO) to galectin-3 (Gal3). A general regulator of inflammation( 3 ), IDO is immunosuppressive( 4 ), catabolizing the essential amino acid tryptophan into kynurenine.( 5 ) Recently we demonstrated that extracellular exogenous IDO regulates innate immune cell function( 6 ), and envisioned delivering IDO into specific tissues would provide control of inflammation. However, proteins problematically diffuse away from local injection sites. Addressing this, we recently established that fusion to Gal3 anchors enzymes to tissues( 7 ) via binding to extracellular glycans. Fusion protein IDO-Gal3 was retained in injected tissues and joints for up to a week or more, where it suppressed local inflammation in rodent models of endotoxin-induced inflammation, psoriasis, periodontal disease and osteoarthritis. Amelioration of local inflammation, disease progression and inflammatory pain were concomitant with homeostatic preservation of tissues without global immune suppression. Thus, IDO-Gal3 presents a new concept of anchoring immunomodulatory enzymes for robust control of focal inflammation in multiple disease settings.

ABSTRACT Objective Investigational cell therapies have been developed as disease-modifying agents for the treatment of osteoarthritis (OA), including those that inducibly respond to inflammatory factors driving OA progression. However, dysregulated inflammatory cascades do not specifically signify the presence of OA. Here, we deploy a synthetic receptor platform that regulates cell behaviors in an arthritis-specific fashion to confine transgene expression to sites characterized by cartilage degeneration. Methods An scFv specific for type II collagen (CII) was used to produce a synthetic Notch (synNotch) receptor that enables “CII-synNotch” mesenchymal stromal cells (MSCs) to recognize CII fibers exposed in damaged cartilage. Engineered cell activation by both CII-treated culture surfaces and on primary tissue samples was measured via inducible reporter transgene expression. TGFβ3-expressing cells were assessed for cartilage anabolic gene expression via qRT-PCR. In a co-culture with CII-synNotch MSCs engineered to express IL-1Ra, ATDC5 chondrocytes were stimulated with IL-1α, and inflammatory responses of ATDC5s were profiled via qRT-PCR and an NF-kB reporter assay. Results CII-synNotch MSCs are highly responsive to CII, displaying activation ranges over 40-fold in response to physiologic CII inputs. CII-synNotch cells exhibit the capacity to distinguish between healthy and damaged cartilage tissue and constrain transgene expression to regions of exposed CII fibers. Receptor-regulated TGFβ3 expression resulted in upregulation of Aca n and Col2a1 in MSCs, and inducible IL-1Ra expression by engineered CII-synNotch MSCs reduced pro-inflammatory gene expression in chondrocytes. Conclusion This work demonstrates proof-of-concept that the synNotch platform guides MSCs for spatially regulated, disease-dependent delivery of OA-relevant biologic drugs.

Short-interfering RNA (siRNA) has gained significant interest for treatment of neurological diseases by providing the capacity to achieve sustained inhibition of nearly any gene target. Yet, achieving efficacious drug delivery throughout deep brain structures of the CNS remains a considerable hurdle. We herein describe a lipid-siRNA conjugate that, following delivery into the cerebrospinal fluid (CSF), is transported effectively through perivascular spaces, enabling broad dispersion within CSF compartments and through the CNS parenchyma. We provide a detailed examination of the temporal kinetics of gene silencing, highlighting potent knockdown for up to five months from a single injection without detectable toxicity. Single-cell RNA sequencing further demonstrates gene silencing activity across diverse cell populations in the parenchyma and at brain borders, which may provide new avenues for neurological disease-modifying therapies.

We report the development of a nanotechnology to co-deliver chemocoxib A with a reactive oxygen species (ROS)-activatable and COX-2 targeted pro-fluorescent probe, fluorocoxib Q (FQ) enabling real time visualization of COX-2 and CA drug delivery into solid cancers, using a di-block PPS

Abstract Short interfering RNAs (siRNAs) are potent nucleic acid-based drugs designed to target disease driving genes that may otherwise be undruggable with small molecules. However, the potential of administering therapeutic siRNA in vivo is limited by poor pharmacokinetic properties, including rapid renal clearance and nuclease degradation. Nanocarriers have traditionally been explored as means to overcome these challenges, but they have intrinsic downsides such as dose-limiting toxicity and synthetic complexity. Backpacking on natural carriers such as albumin, which is present at high concentration and has a long half-life in serum, is an effective way to modify pharmacokinetics of biologic drugs that otherwise have poor bioavailability. In this work, we sought to develop albumin-binding aptamer-siRNA chimeras to improve the bioavailability of siRNA. We used a Systematic Evolution of Ligands through Exponential Enrichment (SELEX) approach to obtain RNA aptamers with modified bases that bind albumin with high affinity. We then fused the aptamers directly to an siRNA to generate the chimera structure. These aptamer-siRNA chimeras are stable in serum, exhibit potent gene knockdown capabilities in vitro , and display extended circulation time in vivo . We suggest that this albumin-binding aptamersiRNA chimera approach is a promising strategy for drug delivery applications.

Abstract Infrared neural stimulation, or INS, is a method of using pulsed infrared light to yield label-free neural stimulation with broad experimental and translational utility. Despite its robust demonstration, the mechanistic and biophysical underpinnings of INS have been the subject of debate for more than a decade. The role of lipid membrane thermodynamics appears to play an important role in how fast IR-mediated heating nonspecifically drives action potential generation. Direct observation of lipid membrane dynamics during INS remains to be shown in a live neural model system. To directly test the involvement of lipid dynamics in INS, we used hyperspectral stimulated Raman scattering (hsSRS) microscopy to study biochemical signatures of high-speed vibrational dynamics underlying INS in a live neural cell culture model. Findings suggest that lipid bilayer structural changes are occurring during INS in vitro in NG108-15 neuroglioma cells. Lipid-specific signatures of cell SRS spectra were found to vary with stimulation energy and radiant exposure. Spectroscopic observations were verified against high-speed ratiometric fluorescence imaging of a conventional lipophilic membrane structure reporter, di-4-ANNEPS. Overall, the presented data supports the hypothesis that INS causes changes in the lipid membrane of neural cells by changing lipid membrane packing order – which coincides with likelihood of cell stimulation. Furthermore, this work highlights the potential of hsSRS as a method to study biophysical and biochemical dynamics safely in live cells.