In recent years, small protein oligomers have been implicated in the aetiology of a number of important amyloid diseases, such as type 2 diabetes, Parkinson's disease and Alzheimer's disease. As a consequence, research efforts are being directed away from traditional targets, such as amyloid plaques, and towards characterization of early oligomer states. Here we present a new analysis method, ion mobility coupled with mass spectrometry, for this challenging problem, which allows determination of in vitro oligomer distributions and the qualitative structure of each of the aggregates. We applied these methods to a number of the amyloid-β protein isoforms of Aβ40 and Aβ42 and showed that their oligomer-size distributions are very different. Our results are consistent with previous observations that Aβ40 and Aβ42 self-assemble via different pathways and provide a candidate in the Aβ42 dodecamer for the primary toxic species in Alzheimer's disease. Ion-mobility mass spectrometry has been used to identify and characterize the oligomeric assemblies of amyloid-β proteins under physiologically relevant conditions. Hexamers and dodecamers are formed only from Aβ42 proteins and the dodecamer is identified as a candidate for the primary toxic agent in the development of Alzheimer's disease.

Under solution conditions where the native state is destabilized, the largely helical polypeptide hormone insulin readily aggregates to form amyloid fibrils with a characteristic cross-β structure. However, there is a lack of information relating the 4.8 Å β-strand repeat to the higher order assembly of amyloid fibrils. We have used cryo-electron microscopy (EM), combining single particle analysis and helical reconstruction, to characterize these fibrils and to study the three-dimensional (3D) arrangement of their component protofilaments. Low-resolution 3D structures of fibrils containing 2, 4, and 6 protofilaments reveal a characteristic, compact shape of the insulin protofilament. Considerations of protofilament packing indicate that the cross-β ribbon is composed of relatively flat β-sheets rather than being the highly twisted, β-coil structure previously suggested by analysis of globular protein folds. Comparison of the various fibril structures suggests that very small, local changes in β-sheet twist are important in establishing the long-range coiling of the protofilaments into fibrils of diverse morphology.

Interpretation of mass spectra is challenging because they report a ratio of two physical quantities, mass and charge, which may each have multiple components that overlap in m/z. Previous approaches to disentangling the two have focused on peak assignment or fitting. However, the former struggle with complex spectra, and the latter are generally computationally intensive and may require substantial manual intervention. We propose a new data analysis approach that employs a Bayesian framework to separate the mass and charge dimensions. On the basis of this approach, we developed UniDec (Universal Deconvolution), software that provides a rapid, robust, and flexible deconvolution of mass spectra and ion mobility-mass spectra with minimal user intervention. Incorporation of the charge-state distribution in the Bayesian prior probabilities provides separation of the m/z spectrum into its physical mass and charge components. We have evaluated our approach using systems of increasing complexity, enabling us to deduce lipid binding to membrane proteins, to probe the dynamics of subunit exchange reactions, and to characterize polydispersity in both protein assemblies and lipoprotein Nanodiscs. The general utility of our approach will greatly facilitate analysis of ion mobility and mass spectra.

Collision cross sections in both helium and nitrogen gases were measured directly using a drift cell with RF ion confinement inserted within a quadrupole/ion mobility/time-of-flight hybrid mass spectrometer (Waters Synapt HDMS, Manchester, U.K.). Collision cross sections for a large set of denatured peptide, denatured protein, native-like protein, and native-like protein complex ions are reported here, forming a database of collision cross sections that spans over 2 orders of magnitude. The average effective density of the native-like ions is 0.6 g cm(-3), which is significantly lower than that for the solvent-excluded regions of proteins and suggests that these ions can retain significant memory of their solution-phase structures rather than collapse to globular structures. Because the measurements are acquired using an instrument that mimics the geometry of the commercial Synapt HDMS instrument, this database enables the determination of highly accurate collision cross sections from traveling-wave ion mobility data through the use of calibration standards with similar masses and mobilities. Errors in traveling-wave collision cross sections determined for native-like protein complexes calibrated using other native-like protein complexes are significantly less than those calibrated using denatured proteins. This database indicates that collision cross sections in both helium and nitrogen gases can be well-correlated for larger biomolecular ions, but non-correlated differences for smaller ions can be more significant. These results enable the generation of more accurate three-dimensional models of protein and other biomolecular complexes using gas-phase structural biology techniques.

A new mass-spectrometry method has been developed to obtain high-resolution spectra of folded proteins bound to lipids; using this technique as well as X-ray crystallography provides evidence for membrane protein conformational change as a result of lipid–protein interaction. Many of the high-resolution membrane protein structures published recently are notable for the presence of lipids closely associated with the protein, prompting the question, how are these lipids influencing membrane complex structure? Carol Robinson and colleagues have developed a new ion mobility mass spectrometry (IM-MS) method that enabled them to obtain mass spectra of folded protein conformations bound to lipids. Using this method they identified lipids that altered the stability of MscL (mechanosensitive channel of large conductance), aquaporin Z and the ammonia channel. They then determined the X-ray crystal structure of the ammonia channel bound to one of these lipids (phosphatidylglycerol), which revealed how a conformational change in a specific loop led to the formation of a phosphatidylglycerol-binding site. The major conclusion from this work is that an individual lipid-binding event can change the stability of a membrane complex. On the cover, IM-MS captures a native membrane protein complex emerging from an ion mobility cell. Shown is the ammonia channel in apo, one- and two-lipid bound states. Previous studies have established that the folding, structure and function of membrane proteins are influenced by their lipid environments1,2,3,4,5,6,7 and that lipids can bind to specific sites, for example, in potassium channels8. Fundamental questions remain however regarding the extent of membrane protein selectivity towards lipids. Here we report a mass spectrometry approach designed to determine the selectivity of lipid binding to membrane protein complexes. We investigate the mechanosensitive channel of large conductance (MscL) from Mycobacterium tuberculosis and aquaporin Z (AqpZ) and the ammonia channel (AmtB) from Escherichia coli, using ion mobility mass spectrometry (IM-MS), which reports gas-phase collision cross-sections. We demonstrate that folded conformations of membrane protein complexes can exist in the gas phase. By resolving lipid-bound states, we then rank bound lipids on the basis of their ability to resist gas phase unfolding and thereby stabilize membrane protein structure. Lipids bind non-selectively and with high avidity to MscL, all imparting comparable stability; however, the highest-ranking lipid is phosphatidylinositol phosphate, in line with its proposed functional role in mechanosensation9. AqpZ is also stabilized by many lipids, with cardiolipin imparting the most significant resistance to unfolding. Subsequently, through functional assays we show that cardiolipin modulates AqpZ function. Similar experiments identify AmtB as being highly selective for phosphatidylglycerol, prompting us to obtain an X-ray structure in this lipid membrane-like environment. The 2.3 Å resolution structure, when compared with others obtained without lipid bound, reveals distinct conformational changes that re-position AmtB residues to interact with the lipid bilayer. Our results demonstrate that resistance to unfolding correlates with specific lipid-binding events, enabling a distinction to be made between lipids that merely bind from those that modulate membrane protein structure and/or function. We anticipate that these findings will be important not only for defining the selectivity of membrane proteins towards lipids, but also for understanding the role of lipids in modulating protein function or drug binding.

C-reactive protein (CRP) is a clinical marker for inflammatory disease and infection, but it also binds to damaged cells and activates complement, a host defence and pro-inflammatory system of serum proteins. Complement-mediated inflammation exacerbates tissue injury in heart attacks, and human CRP increases damage in a rat model of acute myocardial infarction via a complement-dependent mechanism. These observations point to CRP as a possible target for drugs intended to protect the heart. Pepys et al. therefore designed a specific small-molecule CRP inhibitor. Five molecules of this palindromic compound are bound by two pentameric CRP molecules arranged face-to-face, as in the X-ray crystal structure of the complex on the cover. The inhibitor blocks the adverse effects of human CRP in rats with acute myocardial infarction, suggesting that early therapeutic inhibition of CRP might be beneficial for heart attack patients. A new drug inhibits the adverse effects of C-reactive protein, a blood protein that has been shown to exacerbate damage in the heart and brain after blockage of the blood supply. Complement-mediated inflammation exacerbates the tissue injury of ischaemic necrosis in heart attacks and strokes, the most common causes of death in developed countries. Large infarct size increases immediate morbidity and mortality and, in survivors of the acute event, larger non-functional scars adversely affect long-term prognosis. There is thus an important unmet medical need for new cardioprotective and neuroprotective treatments. We have previously shown that human C-reactive protein (CRP), the classical acute-phase protein that binds to ligands exposed in damaged tissue and then activates complement1, increases myocardial and cerebral infarct size in rats subjected to coronary or cerebral artery ligation, respectively2,3. Rat CRP does not activate rat complement, whereas human CRP activates both rat and human complement4. Administration of human CRP to rats is thus an excellent model for the actions of endogenous human CRP2,3. Here we report the design, synthesis and efficacy of 1,6-bis(phosphocholine)-hexane as a specific small-molecule inhibitor of CRP. Five molecules of this palindromic compound are bound by two pentameric CRP molecules, crosslinking and occluding the ligand-binding B-face of CRP and blocking its functions. Administration of 1,6-bis(phosphocholine)-hexane to rats undergoing acute myocardial infarction abrogated the increase in infarct size and cardiac dysfunction produced by injection of human CRP. Therapeutic inhibition of CRP is thus a promising new approach to cardioprotection in acute myocardial infarction, and may also provide neuroprotection in stroke. Potential wider applications include other inflammatory, infective and tissue-damaging conditions characterized by increased CRP production, in which binding of CRP to exposed ligands in damaged cells may lead to complement-mediated exacerbation of tissue injury.

We have examined the architecture of a protein complex in the absence of bulk water. By determining collision cross sections of assemblies of the trp RNA binding protein, TRAP, we established that the 11-membered ring topology of the complex can be maintained within a mass spectrometer. We also found that the binding of tryptophan enhances the stability of the ring structure and that addition of a specific RNA molecule increases the size of the complex and prevents structural collapse. These results provide definitive evidence that protein quaternary structure can be maintained in the absence of bulk water and highlight the potential of ion mobility separation for defining shapes of heterogeneous macromolecular assemblies.