Abstract Techniques to analyze and sort single cells based on functional outputs, such as secreted products, have the potential to transform our understanding of cellular biology, as well as accelerate the development of next generation cell and antibody therapies. However, secreted molecules rapidly diffuse away from cells, and analysis of these products requires specialized equipment and expertise to compartmentalize individual cells and capture their secretions. Herein we demonstrate the use of suspendable microcontainers to sort single viable cells based on their secreted products at high-throughput using only commonly accessible laboratory infrastructure. Our microparticles act as solid supports which facilitate cell attachment, partition uniform aqueous compartments, and capture secreted proteins. Using this platform, we demonstrate high-throughput screening of stably- and transiently-transfected producer cells based on relative IgG production as well as screening of B lymphocytes and hybridomas based on antigen-specific antibody production using commercially available flow sorters. Leveraging the high-speed sorting capabilities of standard sorters, we sorted >1,000,000 events in less than an hour. The reported microparticles can be easily stored, and distributed as a consumable reagent amongst researchers, democratizing access to high-throughput functional cell screening.

Abstract Immune cell function is intrinsically linked to secreted factors which enable cells to communicate with neighboring or distant cells to coordinate a response. The ability to secrete cytokines also can help define the population of cells with therapeutic potential in emerging cell therapies, such as chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapies. Polyfunctional cells that can secrete more than one cytokine have been found to play an outsized role in therapeutic efficacy. While there are a variety of techniques to analyze cellular secretions from individual polyfunctional cells, there are no widely-available approaches to sort viable cells based on this phenotype. Here, we apply lab on a particle technology to the analysis and sorting of T cells based on a combination of secreted factors, interferon gamma (IFN-γ), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 2 (IL-2) and surface markers (CD8+ and CD4+). Cells are selectively loaded into the antibody-functionalized cavity of micro-hydrogel particles, called nanovials, where secreted cytokines are captured and fluorescently stained. By leveraging standard fluorescence activated cell sorters and using fluorescence pulse area/height information we can distinguish between fluorescence signals on the nanovial cavities and on cells, and are able to process greater than 1 million nanovials in one hour of sorting. The frequency of multi-cytokine secreting cells was correlated with surface marker expression, and biased towards CD4+ T cells. CD8+ cells that secreted more than one cytokine, were biased towards IFN-γ and TNF-α with fewer CD8+ cells secreting IL-2. The majority of cells with a polyfunctional phenotype that were sorted remained viable and regrew following sorting. This nanovial cytokine secretion assay can be applied to sort antigen-specific T cells or CAR-T cells based on their functional engagement with cognate antigens or peptide-major histocompatibility complexs (MHCs), enabling discovery of functional CARs or T cell receptors and deeper investigation into the molecular underpinnings of single T cell function.

ABSTRACT Protein secretion drives many functions in vivo ; however, methods to link secretions with surface markers and transcriptomes have been lacking. By accumulating secretions close to secreting cells held within cavity-containing hydrogel nanovials, we demonstrate workflows to analyze the amount of IgG secreted from single human antibody-secreting cells and link this information to surface marker expression and transcriptional profiles from the same cells. Measurements using flow cytometry and imaging flow cytometry corroborated an association between levels of IgG secretion and CD138 expression. Using oligonucleotide-labeled antibodies and droplet-based sequencing, we show that pathways encoding protein localization to the endoplasmic reticulum, NADH complex assembly, and mitochondrial respiration were most associated with high IgG secretion. Altogether, this method links secretion information to cell surface and single-cell sequencing information (SEC-seq) and enables exploration of links between genome and secretory function, laying the foundation for numerous discoveries in immunology, stem cell biology, and beyond.

Abstract Critical challenges remain in clinical translation of extracellular vesicle (EV)-based therapeutics due to the absence of methods to enrich cells with high EV secretion. Current cell sorting methods are limited to surface markers that are uncorrelated to EV secretion or therapeutic potential. Here, we utilize a nanovial technology for enrichment of millions of single cells based on EV secretion. This approach is applied to select mesenchymal stem cells (MSCs) with high EV secretion as therapeutic cells for improving treatment. The selected MSCs exhibit distinct transcriptional profiles associated with EV biogenesis and vascular regeneration and maintain high levels of EV secretion after sorting and regrowth. In a mouse model of myocardial infarction, treatment with high-secreting MSCs improves heart functions compared to treatment with low-secreting MSCs. These findings highlight the therapeutic importance of EV secretion in regenerative cell therapies and suggest that selecting cells based on EV secretion could enhance therapeutic efficacy.

The ability to selectively bind to antigenic peptides and secrete cytokines can define populations of cells with therapeutic potential in emerging T cell receptor (TCR) immunotherapies. We leverage cavity-containing hydrogel microparticles, called nanovials, each coated with millions of peptide-major histocompatibility complex (pMHC) monomers to isolate antigen-reactive T cells. T cells are captured and activated by pMHCs and secrete cytokines on nanovials, allowing sorting based on both affinity and function. The TCRs of sorted cells on nanovials are sequenced, recovering paired αβ-chains using microfluidic emulsion-based single-cell sequencing. By labeling nanovials having different pMHCs with unique oligonucleotide-barcodes we could link TCR sequence to targets with 100% accuracy. We identified with high specificity an expanded repertoire of functional TCRs targeting viral antigens compared to standard techniques.

Abstract The study of flow and particle dynamics in microfluidic cross-slot channels is of high relevance for lab-on-a-chip applications. In this work we investigate the dynamics of a rigid spherical particle in a cross-slot junction for a channel height-to-width ratio of 0.6 and at a Reynolds number of 120 for which a steady vortex exists in the junction area. Using an in-house immersed- boundary-lattice-Boltzmann code, we analyse the effect of the entry position of the particle in the junction and the particle size on the dynamics and trajectory shape of the particle. We find that the dynamics of the particle depends strongly on its lateral entry position in the junction and weakly on its vertical entry position; particles that enter close to the centre show trajectory oscillations. Larger particles have longer residence times in the junction and tend to oscillate less due to their confinement. Our work contributes to the understanding of the particle dynamics in intersecting flows and enables the design of optimised geometries for cytometry and particle manipulation.

Abstract Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds consist of a slurry of hydrogel microspheres that undergo annealing to form a solid scaffold. MAP scaffolds have contained functional groups with dual abilities to participate in Michael-type addition (gelation) and radical polymerization (photoannealing). Functional groups with efficient Michael-type additions react with thiols and amines under physiological conditions, limiting usage for therapeutic delivery. We present a heterofunctional maleimide/methacrylamide 4-arm PEG macromer (MethMal) engineered for selective photopolymerization compatible with multiple polymer backbones. Rheology using two classes of photoinitiators demonstrates advantageous photopolymerization capabilities. Functional assays show benefits for therapeutic delivery and 3D printing without impacting cell viability.

Cells secrete numerous bioactive molecules essential for the function of healthy organisms. However, there are no scalable methods to link individual cell secretions to their transcriptional state. By developing and using secretion encoded single-cell sequencing (SEC-seq), which exploits hydrogel nanovials to capture individual cells and their secretions, we simultaneously measured the secretion of vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) and the transcriptome for thousands of individual mesenchymal stromal cells (MSCs). We found that VEGF-A secretion is heterogeneous across the cell population and lowly correlated with the VEGFA transcript level. While there is a modest population-wide increase in VEGF-A secretion by hypoxic induction, highest VEGF-A secretion across normoxic and hypoxic culture conditions occurs in a subpopulation of MSCs characterized by a unique gene expression signature. Taken together, SEC-seq enables the identification of specific genes involved in the control of secretory states, which may be exploited for developing means to modulate cellular secretion for disease treatment.

Point-of-care (POC) serological testing provides actionable information for several difficult to diagnose illnesses, empowering distributed health systems. Accessible and adaptable diagnostic platforms that can assay the repertoire of antibodies formed against pathogens are essential to drive early detection and improve patient outcomes. Here, we report a POC serologic test for Lyme disease (LD), leveraging synthetic peptides tuned to be highly specific to the LD antibody repertoire across patients and compatible with a paper-based platform for rapid, reliable, and cost-effective diagnosis. A subset of antigenic epitopes conserved across Borrelia burgdorferi genospecies and targeted by IgG and IgM antibodies, were selected based on their seroreactivity to develop a multiplexed panel for a single-step measurement of combined IgM and IgG antibodies from LD patient sera. Multiple peptide epitopes, when combined synergistically using a machine learning-based diagnostic model, yielded a high sensitivity without any loss in specificity. We blindly tested the platform with samples from the U.S. Centers for Disease Control & Prevention (CDC) LD repository and achieved a sensitivity and specificity matching the lab-based two-tier results with a single POC test, correctly discriminating cross-reactive look-alike diseases. This computational LD diagnostic test can potentially replace the cumbersome two-tier testing paradigm, improving diagnosis and enabling earlier effective treatment of LD patients while also facilitating immune monitoring and surveillance of the disease in the community.

We present a deep learning-based framework to design and quantify point-of-care sensors. As its proof-of-concept and use-case, we demonstrated a low-cost and rapid paper-based vertical flow assay (VFA) for high sensitivity C-Reactive Protein (hsCRP) testing, a common medical test used for quantifying the degree of inflammation in patients at risk of cardio-vascular disease (CVD). A machine learning-based sensor design framework was developed for two key tasks: (1) to determine an optimal configuration of immunoreaction spots and conditions, spatially-multiplexed on a paper-based sensing membrane, and (2) to accurately infer the target analyte concentration based on the signals of the optimal VFA configuration. Using a custom-designed mobile-phone based VFA reader, a clinical study was performed with 85 human serum samples to characterize the quantification accuracy around the clinically defined cutoffs for CVD risk stratification. Results from blindly-tested VFAs indicate a competitive coefficient of variation of 11.2% with a linearity of R2 = 0.95; in addition to the success in the high-sensitivity CRP range (i.e., 0-10 mg/L), our results further demonstrate a mitigation of the hook-effect at higher CRP concentrations due to the incorporation of antigen capture spots within the multiplexed sensing membrane of the VFA. This paper-based computational VFA that is powered by deep learning could expand access to CVD health screening, and the presented machine learning-enabled sensing framework can be broadly used to design cost-effective and mobile sensors for various point-of-care diagnostics applications.