Excessive and prolonged activity of inflammatory monocytes is a hallmark of many diseases with an inflammatory component. In such conditions, precise targeting of these cells could be therapeutically beneficial while sparing many essential functions of the innate immune system, thus limiting unwanted effects. Inflammatory monocytes-but not the noninflammatory subset-depend on the chemokine receptor CCR2 for localization to injured tissue. Here we present an optimized lipid nanoparticle and a CCR2-silencing short interfering RNA that, when administered systemically in mice, show rapid blood clearance, accumulate in spleen and bone marrow, and localize to monocytes. Efficient degradation of CCR2 mRNA in monocytes prevents their accumulation in sites of inflammation. Specifically, the treatment attenuates their number in atherosclerotic plaques, reduces infarct size after coronary artery occlusion, prolongs normoglycemia in diabetic mice after pancreatic islet transplantation, and results in reduced tumor volumes and lower numbers of tumor-associated macrophages.

Monocytes (Mo) and macrophages (MΦ) are emerging therapeutic targets in malignant, cardiovascular, and autoimmune disorders. Targeting of Mo/MΦ and their effector functions without compromising innate immunity’s critical defense mechanisms first requires addressing gaps in knowledge about the life cycle of these cells. Here we studied the source, tissue kinetics, and clearance of Mo/MΦ in murine myocardial infarction, a model of acute inflammation after ischemic injury. We found that a) Mo tissue residence time was surprisingly short (20 h); b) Mo recruitment rates were consistently high even days after initiation of inflammation; c) the sustained need of newly made Mo was fostered by extramedullary monocytopoiesis in the spleen; d) splenic monocytopoiesis was regulated by IL-1β; and e) the balance of cell recruitment and local death shifted during resolution of inflammation. Depending on the experimental approach, we measured a 24 h Mo/MΦ exit rate from infarct tissue between 5 and 13% of the tissue cell population. Exited cells were most numerous in the blood, liver, and spleen. Abrogation of extramedullary monocytopoiesis proved deleterious for infarct healing and accelerated the evolution of heart failure. We also detected rapid Mo kinetics in mice with stroke. These findings expand our knowledge of Mo/MΦ flux in acute inflammation and provide the groundwork for novel anti-inflammatory strategies for treating heart failure.

The aim of this study was to explore post–myocardial infarction (MI) myocardial inflammation. Innate immune cells are centrally involved in infarct healing and are emerging therapeutic targets in cardiovascular disease; however, clinical tools to assess their presence in tissue are scarce. Furthermore, it is currently not known if the nonischemic remote zone recruits monocytes. Acute inflammation was followed in mice with coronary ligation by 18-fluorodeoxyglucose (18FDG) positron emission tomography/magnetic resonance imaging, fluorescence-activated cell sorting, polymerase chain reaction, and histology. Gd-DTPA–enhanced infarcts showed high 18FDG uptake on day 5 after MI. Cell depletion and isolation data confirmed that this largely reflected inflammation; CD11b+ cells had 4-fold higher 18FDG uptake than the infarct tissue from which they were isolated (p < 0.01). Surprisingly, there was considerable monocyte recruitment in the remote myocardium (approximately 104/mg of myocardium, 5.6-fold increase; p < 0.01), a finding mirrored by macrophage infiltration in the remote myocardium of patients with acute MI. Temporal kinetics of cell recruitment were slower than in the infarct, with peak numbers on day 10 after ischemia. Quantitative polymerase chain reaction showed a robust increase of recruiting adhesion molecules and chemokines in the remote myocardium (e.g., 12-fold increase of monocyte chemoattractant protein-1), although levels were always lower than in the infarct. Finally, matrix metalloproteinase activity was significantly increased in noninfarcted myocardium, suggesting that monocyte recruitment to the remote zone may contribute to post-MI dilation. This study shed light on the innate inflammatory response in remote myocardium after MI.

Background— Exaggerated and prolonged inflammation after myocardial infarction (MI) accelerates left ventricular remodeling. Inflammatory pathways may present a therapeutic target to prevent post-MI heart failure. However, the appropriate magnitude and timing of interventions are largely unknown, in part because noninvasive monitoring tools are lacking. Here, we used nanoparticle-facilitated silencing of CCR2, the chemokine receptor that governs inflammatory Ly-6C high monocyte subset traffic, to reduce infarct inflammation in apolipoprotein E–deficient (apoE −/− ) mice after MI. We used dual-target positron emission tomography/magnetic resonance imaging of transglutaminase factor XIII (FXIII) and myeloperoxidase (MPO) activity to monitor how monocyte subset–targeted RNAi altered infarct inflammation and healing. Methods and Results— Flow cytometry, gene expression analysis, and histology revealed reduced monocyte numbers and enhanced resolution of inflammation in infarcted hearts of apoE −/− mice that were treated with nanoparticle-encapsulated siRNA. To follow extracellular matrix cross-linking noninvasively, we developed a fluorine-18–labeled positron emission tomography agent ( 18 F-FXIII). Recruitment of MPO-rich inflammatory leukocytes was imaged with a molecular magnetic resonance imaging sensor of MPO activity (MPO-Gd). Positron emission tomography/magnetic resonance imaging detected anti-inflammatory effects of intravenous nanoparticle-facilitated siRNA therapy (75% decrease of MPO-Gd signal; P <0.05), whereas 18 F-FXIII positron emission tomography reflected unimpeded matrix cross-linking in the infarct. Silencing of CCR2 during the first week after MI improved ejection fraction on day 21 after MI from 29% to 35% ( P <0.05). Conclusion— CCR2-targeted RNAi reduced recruitment of Ly-6C high monocytes, attenuated infarct inflammation, and curbed post-MI left ventricular remodeling.

Abstract Epidemiological studies of the COVID-19 pandemic have revealed evidence of cardiac involvement and documented that myocardial injury and myocarditis are predictors of poor outcomes. Nonetheless, little is understood regarding SARS-CoV-2 tropism within the heart and whether cardiac complications result directly from myocardial infection. Here, we develop a human engineered heart tissue model and demonstrate that SARS-CoV-2 selectively infects cardiomyocytes. Viral infection is dependent on expression of angiotensin-I converting enzyme 2 (ACE2) and endosomal cysteine proteases, suggesting an endosomal mechanism of cell entry. After infection with SARS-CoV-2, engineered tissues display typical features of myocarditis, including cardiomyocyte cell death, impaired cardiac contractility, and innate immune cell activation. Consistent with these findings, autopsy tissue obtained from individuals with COVID-19 myocarditis demonstrated cardiomyocyte infection, cell death, and macrophage-predominate immune cell infiltrate. These findings establish human cardiomyocyte tropism for SARS-CoV-2 and provide an experimental platform for interrogating and mitigating cardiac complications of COVID-19.

Abstract Recovery of cardiac function is the ultimate goal of heart failure therapy. Unfortunately, cardiac recovery remains a rare and poorly understood phemomenon. Herein, we performed single nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq) from non-diseased donors and heart failure patients. By comparing patients who recovered LV systolic function following LV assist device implantation to those who did not recover and donors, we defined the cellular and transcriptional landscape and predictors of cardiac recovery. We sequenced 40 hearts and recovered 185,881 nuclei with 13 distinct cell types. Using pseudobulk differential expression analysis to explicate cell specific signatures of cardiac recovery, we observed that recovered cardiomyocytes do not revert to a normal state, and instead, retain transcriptional signatures observed in heart failure. Macrophages and fibroblasts displayed the strongest signatures of recovery. While some evidence of reversion to a normal state was observed, many heart failure associated genes remained elevated and recovery signatures were predominately indicative of a biological state that was unique from donor and heart failure conditions. Acquisition of recovery states was associated with improved LV systolic function. Pro-inflammatory macrophages and inflammatory signaling in fibroblasts were identified as negative predictors of recovery. We identified downregulation of RUNX1 transcriptional activity in macrophages and fibroblasts as a central event associated with and predictive of cardiac recovery. In silico perturbation of RUNX1 in macrophages and fibroblasts recapitulated the transcriptional state of cardiac recovery. This prediction was corroborated in a mouse model of cardiac recovery mediated by BRD4 inhibition where we observed a decrease in macrophage and fibroblast Runx1 expression, diminished chromatin accessibility within peaks linked to the Runx1 locus, and acquisition of recovery signatures. These findings suggest that cardiac recovery is a unique biological state and identify RUNX1 as a possible therapeutic target to facilitate cardiac recovery.

Rationale Rapid reperfusion is the most effective treatment for attenuating cardiac injury caused by myocardial ischemia. Yet, reperfusion itself elicits damage to the myocardium through incompletely understood mechanisms, known as ischemia/reperfusion (I/R) injury. The myocardium adapts to I/R by changes in gene expression, which determines the cellular response to reperfusion. Protein translation is a key component of gene expression. However, it is unknown how regulation of translation contributes to cardiac gene expression in response to reperfusion and whether it can be targeted to mitigate I/R injury. Methods To examine translation and its impact on gene expression in response to I/R we assessed protein synthesis at different timepoints after ischemia and reperfusion in vitro and in vivo. Pharmacological inhibitors were used to dissect the underlying molecular mechanisms of translational control. Transient inhibition of protein synthesis was undertaken to decipher the effects of the translational response to reperfusion on cardiac function and inflammation. Cell-type-specific ribosome profiling was performed in mice subjected to I/R to determine the impact of translation on the regulation of gene expression in cardiomyocytes. Results Reperfusion increased translation rates from a previously suppressed state during ischemia in cardiomyocytes, which was associated with the induction of cell death. In vivo, I/R resulted in strong activation of translation in the myocardial border zone. Detailed analysis revealed that the upregulation of translation is mediated by eIF4F complex formation, which was specifically mediated by the mTORC1-4EBP1-eIF4F axis. Short-term pharmacological inhibition of eIF4F complex formation by 4EGI-1 or rapamycin, respectively, attenuated translation, reduced infarct size and improved long-term cardiac function after myocardial infarction. Cardiomyocyte-specific ribosome profiling identified that reperfusion damage increased translation of mRNA networks in cardiomyocytes associated with cardiac inflammation and cell infiltration. Transient inhibition of the mTORC1-4EBP1-eIF4F axis decreased the expression of proinflammatory transcripts such as Ccl2, thereby reducing Ly6C hi monocyte infiltration and myocardial inflammation. Conclusions Myocardial reperfusion induces protein synthesis in the border zone which contributes to I/R injury by rapidly translating a specific maladaptive mRNA network that mediates immune cell infiltration and inflammation. Transient inhibition of the mTORC1-4EBP1-eIF4F signaling axis during reperfusion attenuates this proinflammatory translational response, protects against I/R injury and improves long-term cardiac function after myocardial infarction. Clinical Perspective What Is New? This is the first study to investigate the impact of translational regulation on cardiomyocyte gene expression in response to myocardial ischemia/reperfusion. We show that translation regulates approximately two-thirds of differentially expressed genes in cardiomyocytes after ischemia/reperfusion, including many involved in inflammation and immune cell infiltration. The translational response to ischemia/reperfusion is regulated by the mTORC1-4EBP1-eIF4F axis, which determines pro-inflammatory monocyte infiltration via control of the expression of the chemokine Ccl2. What Are the Clinical Implications? Currently, there are no specific therapies to prevent ischemia/reperfusion injury, which is mediated, at least in part, by a maladaptive inflammatory response. A translationally controlled network regulated by the mTORC1-4EBP1-eIF4F axis can be targeted by a short-term pharmacological intervention to attenuate the inflammatory response and improve cardiac function after ischemia/reperfusion in mice. This study supports the emerging concept of selectively inhibiting maladaptive elements of the inflammatory response to improve outcome in patients after myocardial infarction; in addition, it provides a mechanistic basis for the currently ongoing CLEVER-ACS trial.

Summary Mutations in DNA methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) are the most frequent driver of clonal hematopoiesis of indeterminate potential (CHIP), and associated with higher risk of cardiovascular disease and pro-inflammatory activation of immune cells. Here, we investigated the mechanisms underlying DNMT3A CHIP-associated inflammatory phenotypes in macrophages. We show that monocytes of DNMT3A CHIP-driver mutation carriers are associated with DNA hypomethylation of succinate dehydrogenase A (SDHA) and an altered tricarboxylic acid cycle metabolite profile. Silencing of DNMT3A in monocytes increased SDHA and elevated mitochondria complex II activity. The secreted complex II product, malate, further increased inflammatory activation in wild type monocytes to further augment inflammation in a paracrine manner. Pharmacological inhibition of SDHA (using dimethyl malonate) in mice harboring DNMT3A mutations in hematopoietic stem cells ameliorated the inflammatory response and improved cardiac function after myocardial infarction. Thus, interfering with the altered metabolic state may provide a new therapeutic option to dampen inflammatory activation in DNMT3A CHIP carrying patients.

Abstract Hematopoietic mutations in epigenetic regulators like DNA methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) drive clonal hematopoiesis of indeterminate potential (CHIP) and are associated with adverse prognosis in patients with heart failure (HF). The interactions between CHIP-mutated cells and other cardiac cell types remain unknown. Here, we identify fibroblasts as potential interaction partners of CHIP-mutated monocytes using combined transcriptomic data from peripheral blood mononuclear cells of HF patients with and without CHIP and the cardiac tissue. We demonstrate that CHIP augments macrophage-to-cardiac fibroblasts interactions. Mechanistically, the secretome of DNMT3A -silenced monocytes leads to myofibroblast activation, partially through epidermal growth factor (EGFR) signaling. Harboring DNMT3A CHIP-driver mutations is associated with increased cardiac interstitial fibrosis in mice and patients, and, thereby, may contribute to the poor outcome. These findings not only identify a novel pathway of DNMT3A CHIP-driver mutation-induced instigation and progression of HF, but may also provide a rationale for the development of new anti-fibrotic strategies. Graphical abstract

Abstract Inflammation, fibrosis and metabolic stress critically promote heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). Exposure to high-fat diet and nitric oxide synthase inhibitor N[w]-nitro-l-arginine methyl ester (L-NAME) recapitulate features of HFpEF in mice. To identify disease specific traits during adverse remodeling, we profiled interstitial cells in early murine HFpEF using single-cell RNAseq (scRNAseq). Diastolic dysfunction and perivascular fibrosis were accompanied by an activation of cardiac fibroblast and macrophage subsets. Integration of fibroblasts from HFpEF with two murine models for heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF) identified a catalog of conserved fibroblast phenotypes across mouse models. Moreover, HFpEF specific characteristics included induced metabolic, hypoxic and inflammatory transcription factors and pathways, including enhanced expression of Angiopoietin-like 4 next to basement membrane compounds. Fibroblast activation was further dissected into transcriptional and compositional shifts and thereby highly responsive cell states for each HF model were identified. In contrast to HFrEF, where myofibroblast and matrifibrocyte activation were crucial features, we found that these cell-states played a subsidiary role in early HFpEF. These disease-specific fibroblast signatures were corroborated in human myocardial bulk transcriptomes. Furthermore, we found an expansion of pro-inflammatory Ly6C high macrophages in HFpEF, and we identified a potential cross-talk between macrophages and fibroblasts via SPP1 and TNFɑ. Finally, a marker of murine HFpEF fibroblast activation, Angiopoietin-like 4, was elevated in plasma samples of HFpEF patients and associated with disease severity. Taken together, our study provides a comprehensive characterization of molecular fibroblast and macrophage activation patterns in murine HFpEF, as well as the identification of a novel biomarker for disease progression in patients.