Exosomes are extracellular vesicles produced by all cells with a remarkable ability to efficiently transfer genetic material, including exogenously loaded siRNA, to cancer cells. Here, we report on a bioreactor-based, large-scale production of clinical-grade exosomes employing good manufacturing practice (GMP) standards. A standard operating procedure was established to generate engineered exosomes with the ability to target oncogenic Kras (iExosomes). The clinical-grade GMP iExosomes were tested in multiple in vitro and in vivo studies to confirm suppression of oncogenic Kras and an increase in the survival of several mouse models with pancreatic cancer. We perform studies to determine the shelf life, biodistribution, toxicology profile, and efficacy in combination with chemotherapy to inform future clinical testing of GMP iExosomes. Collectively, this report illustrates the process and feasibility of generating clinical-grade exosomes for various therapies of human diseases.

Exosomes are extracellular vesicles derived from the endosomal compartment that are potentially involved in intercellular communication. Here, we found that frequently used biomarkers of exosomes are heterogeneous, and do not exhibit universal utility across different cell types. To uncover ubiquitous and abundant proteins, we used an unbiased and quantitative proteomic approach based on super-stable isotope labeling with amino acids in cell culture (super-SILAC), coupled to high-resolution mass spectrometry. In total, 1,212 proteins were quantified in the proteome of exosomes, irrespective of the cellular source or isolation method. A cohort of 22 proteins was universally enriched. Fifteen proteins were consistently depleted in the proteome of exosomes compared to cells. Among the enriched proteins, we identified biogenesis-related proteins, GTPases and membrane proteins, such as CD47 and ITGB1. The cohort of depleted proteins in exosomes was predominantly composed of nuclear proteins. We identified syntenin-1 as a consistently abundant protein in exosomes from different cellular origins. Syntenin-1 is also present in exosomes across different species and biofluids, highlighting its potential use as a putative universal biomarker of exosomes. Our study provides a comprehensive quantitative atlas of core proteins ubiquitous to exosomes that can serve as a resource for the scientific community. Using an unbiased and quantitative proteomic approach, Kugeratski et al. identified the core constituents of exosomes and found that syntenin-1 was the most abundant component, making it a putative universal biomarker.

Abstract Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is associated with mutations in Kras, a known oncogenic driver of PDAC; and the KRAS G12D mutation is present in nearly half of PDAC patients. Recently, a non-covalent small molecule inhibitor (MRTX1133) was identified with specificity to the Kras G12D mutant protein. Here we explore the impact of Kras G12D inhibition by MRTX1133 on advanced PDAC and its influence on the tumor microenvironment. Employing different orthotopic xenograft and syngeneic tumor models, eight different PDXs, and two different autochthonous genetic models, we demonstrate that MRTX1133 reverses early PDAC growth, increases intratumoral CD8 + effector T cells, decreases myeloid infiltration, and reprograms cancer associated fibroblasts. Autochthonous genetic mouse models treated with MRTX1133 leads to regression of both established PanINs and advanced PDAC. Regression of advanced PDAC requires CD8 + T cells and immune checkpoint blockade therapy (iCBT) synergizes with MRTX1133 to eradicate PDAC and prolong overall survival. Mechanistically, inhibition of mutant Kras in advanced PDAC and human patient derived organoids (PDOs) induces Fas expression in cancer cells and facilitates CD8 + T cell mediated death. These results demonstrate the efficacy of MRTX1133 in different mouse models of PDAC associated with reprogramming of stromal fibroblasts and a dependency on CD8 + T cell mediated tumor clearance. Collectively, this study provides a rationale for a synergistic combination of MRTX1133 with iCBT in clinical trials.

Abstract With the continuous evolution of SARS-CoV-2, variants of concern (VOCs) and their mutations are a focus of rapid assessment. Vital mutations in the VOC are found in spike protein, particularly in the receptor binding domain (RBD), which directly interacts with ACE2 on the host cell membrane, a key determinant of the binding affinity and cell entry. With the reporting of the most recent VOC, omicron, we performed amino acid sequence alignment of the omicron spike protein with that of the wild type and other VOCs. Although it shares several conserved mutations with other variants, we found that omicron has a large number of unique mutations. We applied the Hopp-Woods scale to calculate the hydrophilicity scores of the amino acid stretches of the RBD and the entire spike protein, and found 3 new hydrophilic regions in the RBD of omicron, implying exposure to water, with the potential to bind proteins such as ACE2 increasing transmissibility and infectivity. However, careful analysis reveals that most of the exposed domains of spike protein can serve as antigenic epitopes for generating B cell and T cell-mediated immune responses. This suggests that in the collection of polyclonal antibodies to various epitopes generated after multiple doses of vaccination, some can likely still bind to the omicron spike protein and the RBD to prevent severe clinical disease. In summary, while the omicron variant might result in more infectivity, it can still bind to a reasonable repertoire of antibodies generated by multiple doses of current vaccines likely preventing severe disease. Effective vaccines may not universally prevent opportunistic infections but can prevent the sequelae of severe disease, as observed for the delta variant. This might still be the case with the omicron variant, albeit, with increased frequency of infection.

Inflammation and tissue damage associated with pancreatitis can precede or occur concurrently with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). We demonstrate that in PDAC coupled with pancreatitis (ptPDAC), antigen-presenting type I conventional dendritic cells (cDC1s) are specifically activated. Immune checkpoint blockade therapy (iCBT) leads to cytotoxic CD8 + T cell activation and elimination of ptPDAC with restoration of life span even upon PDAC rechallenge. Using PDAC antigen-loaded cDC1s as a vaccine, immunotherapy-resistant PDAC was rendered sensitive to iCBT with elimination of tumors. cDC1 vaccination coupled with iCBT identified specific CDR3 sequences in the tumor-infiltrating CD8 + T cells with potential therapeutic importance. This study identifies a fundamental difference in the immune microenvironment in PDAC concurrent with, or without, pancreatitis and provides a rationale for combining cDC1 vaccination with iCBT as a potential treatment option.

Evaluating the heterogeneity of extracellular vesicles (EVs) is crucial for unraveling their complex actions and biodistribution. Here, we identify consistent architectural heterogeneity of EVs using cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) which has an inherent ability to image biological samples without harsh labeling methods and while preserving their native conformation. Imaging EVs isolated using different methodologies from distinct sources such as cancer cells, normal cells, and body fluids, we identify a structural atlas of their dominantly consistent shapes. We identify EV architectural attributes by utilizing a segmentation neural network model. In total, 7,576 individual EVs were imaged and quantified by our computational pipeline. Across all 7,576 independent EVs, the average eccentricity was 0.5366, and the average equivalent diameter was 132.43 nm. The architectural heterogeneity was consistent across all sources of EVs, independent of purification techniques, and compromised of single spherical (S. Spherical), rod-like or tubular, and double shapes. This study will serve as a reference foundation for high-resolution EV images and offer insights into their potential biological impact.

Abstract mRNA incorporated in lipid nanoparticles (LNPs) became a new class of vaccine modality for induction of immunity against COVID-19 and ushered in a new era in vaccine development. Here, we report a novel, easy-to-execute, and cost effective engineered extracellular vesicles (EVs)-based combined mRNA and protein vaccine platform (EV X-M+P vaccine) and explore its utility in proof-of-concept immunity studies in the settings of cancer and infectious disease. As a first example, we engineered EVs to contain ovalbumin mRNA and protein (EV OvaM+P ) to serve as cancer vaccine against ovalbumin-expressing melanoma tumors. EV OvaM+P administration to mice with established melanoma tumors resulted in tumor regression associated with effective humoral and adaptive immune responses. As a second example, we generated engineered EVs, natural nanoparticle carriers shed by all cells, that contain mRNA and protein Spike (S) protein to serve as a combined mRNA and protein vaccine (EV SpikeM+P vaccine) against SARS-CoV-2 infection. EV SpikeM+P vaccine administration in mice and baboons elicited robust production of neutralizing IgG antibodies against RBD (receptor binding domain) of S protein and S protein specific T cell responses. Our proof-of-concept study describes a new platform with an ability for rapid development of combination mRNA and protein vaccines employing EVs for deployment against cancer and other diseases.

Extracellular vesicles (EVs) have emerged as potential biomarkers for diagnosing a range of diseases without invasive procedures. Extracellular vesicles also offer advantages compared to synthetic vesicles for delivery of various drugs; however, limitations in segregating EVs from other particles and soluble proteins have led to inconsistent EV retrieval rates with low levels of purity. Here, we report a new high-yield (88.47 %) and rapid (<20 min) EV isolation method termed size exclusion - fast protein liquid chromatography (SE-FPLC). We show SE-FPLC can effectively isolate EVs from multiple sources including EVs derived from human and mouse cells and serum samples. The results indicate that SE-FPLC can successfully remove highly abundant protein contaminants such as albumin and lipoprotein complexes, which can represent a major hurdle in large scale isolation of EVs. The high-yield nature of SE-FPLC allows for easy industrial scaling up of EV production for various clinical utilities. SE-FPLC also enables analysis of small volumes of blood for use in point-of-care diagnostics in the clinic. Collectively, SE-FPLC offers many advantages over current EV isolation methods and offers rapid clinical translation.

Inflammation and tissue damage associated with pancreatitis can precede or occur concurrently with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). We demonstrate that in PDAC coupled with pancreatitis (ptPDAC), antigen-presenting type-I conventional dendritic cells (cDC1s) are specifically activated. Immune checkpoint blockade therapy (iCBT) leads to cytotoxic CD8 + T cell activation and eradication of ptPDAC with restoration of lifespan even upon PDAC re-challenge. Such eradication of ptPDAC was reversed following specific depletion of dendritic cells. Employing PDAC antigen-loaded cDC1s as a vaccine, immunotherapy-resistant PDAC was rendered sensitive to iCBT with a curative outcome. Analysis of the T-cell receptor (TCR) sequences in the tumor infiltrating CD8 + T cells following cDC1 vaccination coupled with iCBT identified unique CDR3 sequences with potential therapeutic significance. Our findings identify a fundamental difference in the immune microenvironment and adaptive immune response in PDAC concurrent with, or without pancreatitis, and provides a rationale for combining cDC1 vaccination with iCBT as a potential treatment option.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) are generated by all cells and systemic administration of allogenic EVs derived from epithelial and mesenchymal cells have been shown to be safe, despite carrying an array of functional molecules, including thousands of proteins. To address whether epithelial cells derived EVs can be modified to acquire the capacity to induce immune response, we engineered 293T EVs to harbor the immunomodulatory CD80, OX40L and PD-L1 molecules. We demonstrated abundant levels of these proteins on the engineered cells and EVs. Functionally, the engineered EVs efficiently elicit positive and negative co-stimulation in human and murine T cells. In the setting of cancer and auto-immune hepatitis, the engineered EVs modulate T cell functions and alter disease progression. Moreover, OX40L EVs provide additional benefit to anti-CTLA-4 treatment in melanoma-bearing mice. Our work provides evidence that epithelial cell derived EVs can be engineered to induce immune responses with translational potential to modulate T cell functions in distinct pathological settings.