Abstract The nucleus is the hallmark of eukaryotic life and transport to and from the nucleus occurs through the nuclear pore complex (NPC). There is a multitude of data connecting the nuclear transport machinery – i.e. the NPCs and associated nuclear transport factors - to neurodegenerative diseases, but the mechanisms are not well understood. Using Saccharomyces cerevisiae , we systematically studied how the expression of polyPR and polyGA related to C9Orf72 amyotrophic lateral sclerosis impacts the nuclear transport machinery. We measured the abundance and localization of NPC components and transport factors, and assessed the kinetics of import and export by four transport receptors. PolyPR and polyGA cause distinct, and transport receptor dependent effects. We compared the specific changes in transport to those obtained when cells were exposed to different stress situations or mutations. This comparison showed similar patterns of transport defects in cells lacking specific NTRs and cells expressing polyPR. In contrast, polyGA expressing cells bear resemblance to stress conditions where energy maintenance is decreased. The similarity of the patterns of transport deficiencies suggests that polyPR has a direct effect on nuclear transport via NTRs, while polyGA impacts the energy state of the cell and subsequently changes transport.

Nuclear pore complexes (NPCs) mediate nucleocytoplasmic transport of specific macromolecules while impeding the exchange of unsolicited material. However, key aspects of this gating mechanism remain controversial. To address this issue, we determined the nanoscopic behavior of the permeability barrier directly within yeast S. cerevisiae NPCs at transport-relevant timescales. We show that the large intrinsically disordered domains of phenylalanine-glycine repeat nucleoporins (FG Nups) exhibit highly dynamic fluctuations to create transient voids in the permeability barrier that continuously shape-shift and reseal, resembling a radial polymer brush. Together with cargo-carrying transport factors the FG domains form a feature called the central plug, which is also highly dynamic. Remarkably, NPC mutants with longer FG domains show interweaving meshwork-like behavior that attenuates nucleocytoplasmic transport in vivo. Importantly, the bona fide nanoscale NPC behaviors and morphologies are not recapitulated by in vitro FG domain hydrogels. NPCs also exclude self-assembling FG domain condensates in vivo, thereby indicating that the permeability barrier is not generated by a self-assembling phase condensate, but rather is largely a polymer brush, organized by the NPC scaffold, whose dynamic gating selectivity is strongly enhanced by the presence of transport factors.

Abstract Proteins assemble into a tremendous variety of dynamic and functional structures. Sensitive measurements directly in cells with a high spatiotemporal resolution are needed to distinguish these different assemblies. Here, we demonstrate precise and continuous monitoring of cytoplasmic protein self-assemblies and their structural transitions. Intermolecular FRET with both the donor and acceptor protein at the same target protein provides high sensitivity while retaining the advantage of straightforward ratiometric imaging. We measure different assembly structures, transient intermediate states’ kinetics, and assembly formation resolved in space and time. Specifically, the method recapitulates that i) the mutant Huntingtin exon1 (mHttex1) protein first forms low-FRET and presumably less ordered assemblies in yeast and human cells, which develop into high-FRET aggregates, ii) the chaperone DNAJB6b prevents low-FRET mHttex1 assemblies, yet coassembles with mHttex1 aggregates, and iii) FUS’ condensates have mutation-dependent nanoscopic structures. FACS measurements allow assembly measurement in a high-throughput manner crucial for screening efforts, while fluorescence microscopy provides spatiotemporally-resolved measurements on the single-condensate level during a cell’s lifetime to assess the biological consequences. Implementation in other native or non-native proteins could provide insight into many studies involving protein condensation or aggregation.

Biogenesis of nuclear pore complexes (NPCs) includes the formation of the permeability barrier composed of phenylalanine-glycine-rich nucleoporins (FG-Nups) that regulate the selective passage/crossing of biomolecules. The FG-Nups are intrinsically disordered and prone to liquid-liquid phase separate 1,2 and aggregate when isolated 3 . It has remained largely unclear how FG-Nups are protected from making inappropriate interactions during NPC biogenesis. We found that DNAJB6, a molecular chaperone of the heat shock protein network, formed foci next to NPCs. The number of these foci decreases upon removal of proteins involved in the early steps of interphase NPC biogenesis. Reversely, when this process is stalled in the last steps, the number of DNAJB6-containing foci increases and they could be identified as herniations at the nuclear envelope (NE). Immunoelectron tomography showed that DNAJB6 localizes inside the lumen of the herniations arising at NPC biogenesis intermediates. Interestingly, loss of DNAJB6 results in annulate lamellae, which are structures containing partly assembled NPCs associated with disturbances in NPC biogenesis. We find that DNAJB6 binds to FG-Nups and can prevent the aggregation of the FG-region of several FG-Nups in cells and in vitro . Together, our data show that DNAJB6 provides quality control during NPC biogenesis and is the first molecular chaperone that is involved in the surveillance of native intrinsically disordered proteins, including FG-Nups.

ABSTRACT Selective transport through the nuclear pore complex (NPC) depends on the dynamic binding of the intrinsically disordered components of the NPC, the FG-nups, with each other and with nuclear transport receptors (NTRs). Hydrophobic interactions with the phenylalanines of FG-nups are critical for this dynamic binding. 1,6-hexanediol (1,6HD), is an aliphatic alcohol that interferes with hydrophobic interactions. Here we assessed the specificity and mechanism by which 1,6HD disrupts the permeability barrier of NPCs in live baker’s yeast cells. Exposure to 1,6HD (10 min, 0-5%) leads to gradual loss of the NPC permeability. This is likely a direct effect on the nuclear transport machinery as cell viability, the pH and ATP levels in the cytosol, as well as the appearance of mitochondria, Golgi, peroxisomes, ER, vacuoles, plasma membrane, nucleolus, secretory pathway and stress granules are not notably changed. There are however effects on the cytoskeleton and Hsp104 to be noted. While 1,6HD treatment does not lead to dissociation or degradation of NPC subunits, a massive relocation of multiple NTRs from NPCs does occur. This displacement quantitatively correlates with the increased passive permeability of NPCs. The loss of NTRs and associated cargo will present a major change in the macromolecular crowding and composition and hence the physicochemical properties of the central channel. We conclude that 1,6HD provides a surprisingly specific intervention to temporarily permeate NPCs and we present evidence that the mechanism includes release of NTRs from the NPCs.

To ensure proper transmission of genetic information, cells need to preserve and faithfully replicate their genome, and failure to do so leads to genome instability, a hallmark of both cancer and aging. Defects in genes involved in guarding genome stability cause several human progeroid syndromes, and an age-dependent accumulation of mutations has been observed in different organisms, from yeast to mammals. However, it is unclear if the spontaneous mutation rate changes during aging, and if specific pathways are important for genome maintenance in old cells. We developed a high-throughput replica-pinning approach to screen for genes important to suppress the accumulation of spontaneous mutations during yeast replicative aging. We found 13 known mutation suppression genes, and 31 genes that had no previous link to spontaneous mutagenesis, and all acted independently of age. Importantly, we identified PEX19, encoding an evolutionarily conserved peroxisome biogenesis factor, as an age-specific mutation suppression gene. While wild-type and pex19Δ young cells have similar spontaneous mutation rates, aged cells lacking PEX19 display an elevated mutation rate. This finding suggests that functional peroxisomes are important to preserve genome integrity specifically in old cells, possibly due to their role in reactive oxygen species metabolism.

The recent unprecedented progress in ageing research and drug discovery brings together fundamental research and clinical applications to advance the goal of promoting healthy longevity in the human population. We, from the gathering at the Aging Research and Drug Discovery Meeting in 2023, summarised the latest developments in healthspan biotechnology, with a particular emphasis on artificial intelligence (AI), biomarkers and clocks, geroscience, and clinical trials and interventions for healthy longevity. Moreover, we provide an overview of academic research and the biotech industry focused on targeting ageing as the root of age-related diseases to combat multimorbidity and extend healthspan. We propose that the integration of generative AI, cutting-edge biological technology, and longevity medicine is essential for extending the productive and healthy human lifespan.

Nuclear transport is facilitated by the Nuclear Pore Complex (NPC) and is essential for life in eukaryotes. The NPC is a long-lived and exceptionally large structure. We asked whether NPC function is compromised in ageing mitotic cells. By imaging of single yeast cells during ageing, we show that the abundance of several NPC components and NPC assembly factors decreases while signs of misassembled NPCs appear. Consequently, nuclear permeability decreases, resulting in decreased dynamics of transcription factor shuttling and increased nuclear compartmentalisation. In support that declining NPC quality control is important in mitotic ageing, we find that the transport kinetics observed in ageing is mimicked in an NPC assembly mutant. Additionally, the single cell life histories reveal that cells that better maintain NPC function are longer lived. We conclude that assembly and quality control of NPCs are major challenges for ageing mitotic cells.