SUMMARY Nucleosome chains fold and self-associate to form higher order structures whose internal organization is unknown. Here, cryo-electron tomography (cryo-ET) of native human chromatin reveals novel folding motifs such as 1) non-uniform nucleosome stacking, 2) intermittent parallel and perpendicular orientations of adjacent nucleosome planes, and 3) an inverse zigzag nucleosome chain path, which deviates from the direct zigzag topology seen in reconstituted nucleosomal arrays. By examining these self-associated structures, we observed prominent nucleosome stacking in-cis and anti-parallel nucleosome interactions in-trans, which are consistent with partial nucleosome interdigitation. Histone citrullination strongly inhibits nucleosome stacking and self-association with a modest effect on chromatin folding, while the reconstituted arrays showed a zigzag topology which undergoes a dramatic unfolding induced by histone citrullination. This study sheds light on the internal structure of compact chromatin nanoparticles and suggests a novel mechanism for how epigenetic changes in chromatin are retained across both open and condensed forms of chromatin.

Abstract Cofilin is best known for its ability to sever actin filaments, and facilitate cytoskeletal recycling inside of cells. At higher concentrations, in vitro , cofilin stabilizes a more flexible, hyper-twisted state of actin known as “cofilactin”, but a structural role for cofilactin, in situ , has not been observed. Combining cryo-electron tomography and live-cell imaging in neuronal growth cones, we show that filopodial actin bundles can switch between a fascin-linked and a cofilin-decorated state, composed of hyper-twisted cofilactin filaments. These cofilactin bundles contribute to the flexibility of filopodial actin networks, thus regulating growth cone searching dynamics. Our results provide mechanistic insight into the processes underlying proper brain development, as well as fundamentals of cytoskeletal mechanics inside confined cellular spaces.

Cell division in many eukaryotes is driven by a ring containing actin and myosin. While much is known about the main proteins involved, the precise arrangement of actin filaments within the contractile machinery, and how force is transmitted to the membrane remains unclear. Here we use cryosectioning and cryo-focused ion beam milling to gain access to cryo-preserved actomyosin rings in Schizosaccharomyces pombe for direct three-dimensional imaging by electron cryotomography. Our results show that straight, overlapping actin filaments, running nearly parallel to each other and to the membrane, form a loose bundle of approximately 150 nm in diameter that "saddles" the inward-bending membrane at the leading edge of the division septum. The filaments do not make direct contact with the membrane. Our analysis of the actin filaments reveals the variability in filament number, nearest-neighbor distances between filaments within the bundle, their distance from the membrane and angular distribution with respect to the membrane.

Cytokinesis in most eukaryotic cells is orchestrated by a contractile actomyosin ring. While many of the proteins involved are known, the mechanism of constriction remains unclear. Informed by existing literature and new 3D molecular details from electron cryotomography, here we develop 3D coarse-grained models of actin filaments, unipolar and bipolar myosins, actin crosslinkers, and membranes and simulate their interactions. Exploring a matrix of possible actomyosin configurations suggested that node-based architectures like those presently described for ring assembly result in membrane puckers not seen in EM images of real cells. Instead, the model that best matches data from fluorescence microscopy, electron cryotomography, and biochemical experiments is one in which actin filaments transmit force to the membrane through evenly-distributed, membrane-attached, unipolar myosins, with bipolar myosins in the ring driving contraction. While at this point this model is only favored (not proven), the work highlights the power of coarse-grained biophysical simulations to compare complex mechanistic hypotheses.

ABSTRACT Purpose Previous studies in our lab found that expression of R345W-Fibulin-3 induces retinal pigment epithelial (RPE) cells to undergo epithelial-mesenchymal transition (EMT). The purpose of the current study was to investigate the size, cargo and function of extracellular vesicles (EVs) derived from RPE cells expressing wild-type (WT)-Fibulin-3 compared to RPE cells expressing the R345W-Fibulin-3 mutation, and to determine the role of these EVs in regulating RPE cell dysfunction. Methods ARPE-19 cells were infected with luciferase-tagged wild-type Fibulin-3 (WT)- or luciferase-tagged R345W-Fibulin-3 (mutant) using lentivirus. EVs were isolated from the media of ARPE-19 cells by conventional ultracentrifugation or density gradient ultracentrifugation. Transmission electron microscopy (TEM) and cryogenic electron microscopy (cryo-EM) were performed to study the morphology of the EVs. The amount and size distribution of EVs were determined by Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). EV protein concentrations were quantified using the DCTM Protein Assay (Bio-Rad). EV cargo were analyzed by unbiased proteomics using LC-MS/MS with subsequent pathway analysis (Advaita). The EV-associated transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) protein was measured by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The EV transplant study was conducted and migration ability was evaluated in ARPE-19 cells with or without exposure to EVs by conducting scratch assays. Results TEM imaging revealed concave-appearing vesicles, and cryo-EM imaging showed spherical vesicles with two subpopulations of EVs: a small group with diameters around 30nm and a large group with diameters around 100nm. Imaging also indicated a greater number of small EVs (~30 nm) in the mutant group compared to the WT group. This result was further confirmed by NTA showing that, in the mutant group, the particle size distributions were smaller than those of the WT EVs. There were no significant differences in EV protein concentrations per EV between WT and mutant groups. Proteomic studies showed that EVs derived from ARPE-19 cells expressing WT-Fibulin-3 contain critical members of sonic hedgehog signaling (SHH) signaling and ciliary tip components, whereas EVs derived from RPE cells expressing R345W-Fibulin-3 contain EMT mediators, including TGF-β-induced protein (TGFBI), vimentin, and mothers against decapentaplegic homolog 4 (SMAD4), indicating that the EV cargo reflects the phenotypic status of their parental cells. Subsequent studies revealed enhanced activity of TGF-β1 associated with mutant EVs compared to WT EVs. Critically, EV transplant studies showed that treatment of recipient RPE cells with mutant RPE cell-derived EVs was sufficient to induce an enhanced migration ability and elevated EMT marker expression of RPE cells. Conclusions The expression of R345W-Fibulin-3 alters the size, cargo and autocrine function of EVs. Notably, EVs derived from RPE cells expressing R345W-Fibulin-3 are sufficient to induce EMT in uninfected RPE cells.

Deep learning excels at cryo-tomographic image restoration and segmentation tasks but is hindered by a lack of training data. Here we introduce cryo-TomoSim (CTS), a MATLAB-based software package that builds coarse-grained models of macromolecular complexes embedded in vitreous ice and then simulates transmitted electron tilt series for tomographic reconstruction. We then demonstrate the effectiveness of these simulated datasets in training different deep learning models for use on real cryotomographic reconstructions. Computer-generated ground truth datasets provide the means for training models with voxel-level precision, allowing for unprecedented denoising and precise molecular segmentation of datasets. By modeling phenomena such as a three-dimensional contrast transfer function, probabilistic detection events, and radiation-induced damage, the simulated cryo-electron tomograms can cover a large range of imaging content and conditions to optimize training sets. When paired with small amounts of training data from real tomograms, networks become incredibly accurate at segmenting in situ macromolecular assemblies across a wide range of biological contexts.

ABSTRACT The aggregation of amyloid beta (Aβ) peptide is associated with Alzheimer’s disease (AD) pathogenesis. Cell membrane composition, especially monosialotetrahexosylganglioside (GM1), is known to promote the formation of Aβ fibrils, yet little is known about the roles of GM1 in the early steps of Aβ oligomer formation. Here, by using GM1-contained liposomes as a mimic of neuronal cell membrane, we demonstrate that GM1 is a critical trigger of Aβ oligomerization and aggregation. We find that GM1 not only promotes the formation of Aβ fibrils, but also facilitates the maintenance of Aβ oligomers on liposome membranes. We structurally characterize the Aβ oligomers formed on the membrane and find that GM1 captures Aβ by binding to its arginine-5 residue. To interrogate the mechanism of Aβ oligomer toxicity, we design a new liposome-based Ca 2+ -encapsulation assay and provide new evidence for the Aβ ion channel hypothesis. Finally, we conduct cell viability assay to determine the toxicity of Aβ oligomers formed on membranes. Overall, by uncovering the roles of GM1 in mediating early Aβ oligomer formation and maintenance, our work provides a novel direction for pharmaceutical research for AD.