ABSTRACT Focal gene amplifications are among the most common cancer-associated mutations, but their evolution and contribution to tumorigenesis have proven challenging to recapitulate in primary cells and model organisms. Here we describe a general approach to engineer large (>1 Mbp) focal amplifications mediated by extrachromosomal circular DNAs (ecDNAs, also known as “double minutes”) in a spatiotemporally controlled manner in cancer cell lines and in primary cells derived from genetically engineered mice. With this strategy, ecDNA formation can be coupled with expression of fluorescent reporters or other selectable markers to enable the identification and tracking of ecDNA-containing cells. We demonstrate the feasibility of this approach by engineering MDM2-containing ecDNAs in near-diploid human cells, showing that GFP expression can be used to track ecDNA dynamics under physiological conditions or in the presence of specific selective pressures. We also apply this approach to generate mice harboring inducible Myc - and Mdm2 -containing ecDNAs analogous to those spontaneously occurring in human cancers. We show that the engineered ecDNAs rapidly accumulate in primary cells derived from these animals, promoting proliferation, immortalization, and transformation.

Myoepithelial carcinoma (MECA) is an aggressive salivary gland cancer with largely unknown genetic features. We comprehensively analyzed molecular alterations in 40 MECAs using integrated genomic analyses. We identified a low mutational load, and high prevalence (70%) of oncogenic gene fusions. Most fusions involved the PLAG1 oncogene, and were associated with PLAG1 overexpression. We found FGFR1-PLAG1 in 7 (18%) cases, and the novel TGFBR3-PLAG1 fusion in 6 (15%) cases. TGFBR3-PLAG1 promoted a tumorigenic phenotype in vitro, and was absent in 723 other salivary gland tumors. Other novel PLAG1 fusions included ND4-PLAG1; a fusion between mitochondrial and nuclear DNA. Certain gene fusions were predicted to result in neoantigens with high MHC binding affinity. Copy number alteration was associated with poorer prognosis. Our findings indicate MECA is a fusion-driven disease, nominate TGFBR3-PLAG1 as a hallmark of MECA, and provide a framework for future steps of diagnostic and therapeutic research in this lethal cancer.

Genomic rearrangements are a hallmark of childhood solid tumors, but their mutational causes remain poorly understood. Here, we identify the piggyBac transposable element derived 5 (PGBD5) gene as an enzymatically active human DNA transposase expressed in the majority of rhabdoid tumors, a lethal childhood cancer. Using assembly-based whole-genome DNA sequencing, we observed previously unknown somatic genomic rearrangements in primary human rhabdoid tumors. These rearrangements were characterized by deletions and inversions involving PGBD5-specific signal (PSS) sequences at their breakpoints, with some recurrently targeting tumor suppressor genes, leading to their inactivation. PGBD5 was found to be physically associated with human genomic PSS sequences that were also sufficient to mediate PGBD5-induced DNA rearrangements in rhabdoid tumor cells. We found that ectopic expression of PGBD5 in primary immortalized human cells was sufficient to promote penetrant cell transformation in vitro and in immunodeficient mice in vivo. This activity required specific catalytic residues in the PGBD5 transposase domain, as well as end-joining DNA repair, and induced distinct structural rearrangements, involving PSS-associated breakpoints, similar to those found in primary human rhabdoid tumors. This defines PGBD5 as an oncogenic mutator and provides a plausible mechanism for site specific DNA rearrangements in childhood and adult solid tumors.

Abstract Immune checkpoint blockade (ICB) has demonstrated clinical success in “inflamed” tumors with significant T-cell infiltrates, but tumors with an immune-desert tumor microenvironment (TME) fail to benefit. The tumor cell-intrinsic molecular mechanisms of the immune-desert phenotype remain poorly understood. Here, we demonstrate that inactivation of the Polycomb-repressive complex 2 (PRC2) core components, EED or SUZ12, a prevalent genetic event in malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST) and sporadically in other cancer types, drives a context-dependent immune-desert TME. PRC2 inactivation reprograms the chromatin landscape that leads to a cell-autonomous shift from primed baseline signaling-dependent cellular responses (e.g., interferon γ) to PRC2-regulated development and cellular differentiation transcriptional programs. Further, PRC2 inactivation reprograms the TME, leads to diminished tumor immune infiltrates and immune evasion through reduced chemokine production and impaired antigen presentation and T-cell priming, and confers ICB primary resistance through blunted T-cell recruitment in vivo . We demonstrate that strategies that enhancing innate immunity via intratumoral delivery of inactivated modified vaccinia virus Ankara (MVA) leads to increased tumor immune infiltrates and sensitizes PRC2-loss tumors to ICB. Our results provide novel molecular mechanisms of context-dependent dysfunctional epigenetic reprogramming that underline the immune-desert phenotype in MPNST and other cancers with PRC2 inactivation. Importantly, our findings highlight genetic-inactivation of PRC2 as a novel context-dependent ICB therapeutic resistance biomarker in cancer, and caution that therapeutic strategies that non-selectively target PRC2 in the host may lead to undesirable context-dependent immune evasion and ICB resistance in tumors. Our studies also point to intratumoral delivery of immunogenic therapeutic viruses as an initial strategy to modulate the immune-desert TME and capitalize on the clinical benefit of ICB.

ABSTRACT Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) establishes and maintains di- and tri-methylation at histone 3 at lysine 27 (H3K27me2/3) in the genome and plays oncogenic and tumor suppressor roles in context-dependent cancer pathogenesis. While there is clinical success of therapeutically targeting PRC2 core component, EZH2, in PRC2-dependent cancers (e.g., follicular lymphoma, epithelioid sarcoma), it remains an unmet therapeutic bottleneck in PRC2-inactivated cancer. Biallelic inactivating mutations in PRC2 core components are a hallmark feature of high-grade malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST), an aggressive subtype of sarcoma with poor prognosis and no effective targeted therapeutics. Using a custom RNAi-based drop out screen, we observed that PRC2-inactivation is synthetic lethal with DNA methyltransferase 1 (DNMT1) downregulation; we further observed that small molecule DNMT inhibitors (DNMTis) resulted in enhanced cytotoxicity and antitumor response in PRC2-loss cancer context in vitro and in vivo . Mechanistically, DNMTi-mediated de-repression of retrotransposons (e.g., endogenous retroviral elements (ERVs)/LTR, LINE, SINE) and gene targets is partly restricted by PRC2, which potentially contributes to limited therapeutic activity in PRC2-wild-type (wt) cancer context. In contrast, DNMTi treatment synergizes with PRC2 inactivation and cooperatively amplifies the expression of retrotransposons (e.g., ERV/LTR, LINE, SINE), and subsequent viral mimicry response that promotes robust cell death in part through PKR-dependent double stranded-RNA (dsRNA) sensing. Collectively, our observations posit DNA methylation as a safeguard against anti-tumorigenic cell fate decisions in the context of PRC2-inactivation to promote cancer pathogenesis. Further, they identified a novel targeted therapeutic strategy in PRC2-inactivated MPNST and delineated the PRC2-inactivated cancer context for future preclinical exploration and clinical investigation of DNMT1-targeted therapies in cancer. SIGNIFICANCE PRC2-inactivation drives oncogenesis in various cancers but therapeutically targeting PRC2-loss has remained challenging. Here we show that PRC2 inactivating mutations sets up a tumor context-specific liability for synthetic lethal interaction with genetic and therapeutic inhibition of DNMT1. DNMT1 inhibitor-induced cytotoxicity in PRC2-loss cancer context is accompanied by innate immune signaling signature through PKR-mediated sensing of endogenous retrotransposons. These observations posit a therapeutic window via direct anti-tumor effect by DNMT1 inhibitors in PRC2-loss cancers, and point to potentials to be combined with innovative immunotherapeutic strategies to capitalize on innate immune signaling activation.