Active oxygen species (AOS) are believed to have important roles in plants in general and in plant—pathogen interactions in particular. They are believed to be involved in signal transduction, cell wall reinforcement, hypersensitive response (HR) and phytoalexin production, and to have direct antimicrobial effects. Since current methods are inadequate for localizing AOS in intact plant tissue, most studies have been conducted using cell suspension culture/elicitors systems. 3,3‐diaminobenzidine (DAB) polymerizes instantly and locally as soon as it comes into contact with H 2 O 2 in the presence of peroxidase, and it was found that, by allowing the leaf to take up this substrate, in‐vivo and in‐situ detection of H 2 O 2 can be made at subcellular levels. This method was successfully used to detect H 2 O 2 in developing papillae and surrounding haloes (cell wall appositions) and whole cells of barley leaves interacting with the powdery mildew fungus. Thus, H 2 O 2 can be detected in the epidermal cell wall subjacent to the primary germ tube from 6 h after inoculation, and subjacent to the appressorium from 15 h. The earliest time point for observation of H 2 O 2 in relation to epidermal cells undergoing HR is 15 h after inoculation, first appearing in the zones of attachment to the mesophyll cells underneath, and eventually in the entire epidermal cell. Furthermore, it was observed that proteins in papillae and HR cells are cross‐linked, a process believed to be fuelled by H 2 O 2 . This cross‐linking reinforces the apposition, presumably assisting the arrest of the pathogen.

Abstract Accurate chromosome segregation, controlled by kinetochore-mediated chromatid attachments to the mitotic spindle, ensures the faithful inheritance of genetic information. Kinetochores assemble onto specialized CENP-A nucleosomes (CENP-A Nuc ) of centromeric chromatin. In humans, this is mostly organized as thousands of copies of an ∼171 bp α -satellite repeat. Here, we describe the cryo-EM structure of the human inner kinetochore CCAN (Constitutive Centromere Associated Network) complex bound to CENP-A Nuc reconstituted onto α-satellite DNA. CCAN forms edge-on contacts with CENP-A Nuc , while a linker DNA segment of the α-satellite repeat emerges from the fully-wrapped end of the nucleosome to thread through the central CENP-LN channel which tightly grips the DNA. The CENP-TWSX histone-fold module, together with CENP-HIK Head , further augments DNA binding and partially wraps the linker DNA in a manner reminiscent of canonical nucleosomes. Our study suggests that the topological entrapment of the α -satellite repeat linker DNA by CCAN provides a robust mechanism by which the kinetochore withstands the pushing and pulling of centromeres associated with chromosome congression and segregation forces. One-Sentence Summary The human inner kinetochore CCAN complex tightly grips the linker DNA of the α-satellite CENP-A nucleosome.

Summary The point centromere of budding yeast specifies assembly of the large multi-subunit kinetochore complex. By direct attachment to the mitotic spindle, kinetochores couple the forces of microtubule dynamics to power chromatid segregation at mitosis. Kinetochores share a conserved architecture comprising the centromere-associated inner kinetochore CCAN (constitutive centromere-associated network) complex and the microtubule-binding outer kinetochore KMN network. The budding yeast inner kinetochore additionally includes the centromere-binding CBF1 and CBF3 complexes. Here, we reconstituted the complete yeast inner kinetochore complex assembled onto the centromere-specific CENP-A nucleosome (CENP-A Nuc ) and determined its structure using cryo-EM. This revealed a central CENP-A Nuc , wrapped by only one turn of DNA, and harboring extensively unwrapped DNA ends. These free DNA duplexes function as binding sites for two CCAN protomers, one of which entraps DNA topologically and is positioned precisely on the centromere by the sequence-specific DNA-binding complex CBF1. The CCAN protomers are connected through CBF3 to form an arch-like configuration, binding 150 bp of DNA. We also define a structural model for a CENP-A Nuc -pathway to the outer kinetochore involving only CENP-QU. This study presents a framework for understanding the basis of complete inner kinetochore assembly onto a point centromere, and how it organizes the outer kinetochore for robust chromosome attachment to the mitotic spindle.

Abstract During mitosis, unattached kinetochores trigger the spindle assembly checkpoint by promoting assembly of the mitotic checkpoint complex, a heterotetramer comprising Mad2, Cdc20, BubR1 and Bub3. Critical to this process is the kinetochore-mediated catalysis of an intrinsically slow conformational conversion of Mad2 from an open (O-Mad2) inactive state to a closed (C-Mad2) active state bound to Cdc20. These Mad2 conformational changes involve substantial remodelling of the N-terminal β1 strand and C-terminal β7/β8 hairpin. In vitro , the Mad2- interaction motif (MIM) of Cdc20 (Cdc20 MIM ) triggers rapid conversion of O- to C-Mad2, effectively removing the kinetic barrier for MCC assembly. How Cdc20 MIM directly induces Mad2 conversion remains unclear. In this study we demonstrate that the Cdc20 MIM -binding site is inaccessible in O-Mad2. Time-resolved NMR and molecular dynamics simulations show how Mad2 conversion involves sequential conformational changes of flexible structural elements in O-Mad2, orchestrated by Cdc20 MIM . Conversion is initiated by the β7/β8 hairpin of O-Mad2 transiently unfolding to expose a nascent Cdc20 MIM -binding site. Engagement of Cdc20 MIM to this site promotes release of the β1 strand. We propose that initial conformational changes of the β7/β8 hairpin allows binding of Cdc20 MIM to a transient intermediate state of Mad2, thereby lowering the kinetic barrier to Mad2 conversion.

Abstract The RNA polymerase inhibitor, favipiravir, is currently in clinical trials as a treatment for infection with SARS-CoV-2, despite limited information about the molecular basis for its activity. Here we report the structure of favipiravir ribonucleoside triphosphate (favipiravir-RTP) in complex with the SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) bound to a template:primer RNA duplex, determined by electron cryomicroscopy (cryoEM) to a resolution of 2.5 Å. The structure shows clear evidence for the inhibitor at the catalytic site of the enzyme, and resolves the conformation of key side chains and ions surrounding the binding pocket. Polymerase activity assays indicate that the inhibitor is weakly incorporated into the RNA primer strand, and suppresses RNA replication in the presence of natural nucleotides. The structure reveals an unusual, non-productive binding mode of favipiravir-RTP at the catalytic site of SARS-CoV-2 RdRp which explains its low rate of incorporation into the RNA primer strand. Together, these findings inform current and future efforts to develop polymerase inhibitors for SARS coronaviruses.

SUMMARY CDC20 is a co-activator of the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C) and is essential for mitotic progression. APC/C CDC20 is inhibited by the spindle assembly checkpoint (SAC), which prevents premature separation of sister chromatids and aneuploidy in daughter cells. Although overexpression of CDC20 is common in many cancers, oncogenic mutations have never been identified in humans. Using whole exome sequencing, we identified heterozygous missense CDC20 variants (L151R and N331K) that segregate with cancer in two families. Characterization of these mutants showed they retain APC/C activation activity but show reduced binding to BUBR1, a component of the SAC. Expression of L151R and N331K promoted mitotic slippage in HeLa cells and primary skin fibroblasts derived from carriers. CRISPR/Cas9 was used to generate mice carrying N331K. Homozygous mice carrying N331K were non-viable, however, heterozygotes displayed accelerated oncogenicity in Myc-driven cancers. These findings highlight an unappreciated role for CDC20 variants as tumor promoting genes in humans.

Abstract The multi-subunit anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) is a master regulator of cell division. It controls progression through the cell cycle by timely marking mitotic cyclins and other cell cycle regulatory proteins for degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. The APC/C itself is regulated by the sequential action of its coactivator subunits CDC20 and CDH1, post-translational modifications, and its inhibitory binding partners EMI1 and the mitotic checkpoint complex (MCC). In this study, we took advantage of the latest developments in cryo-electron microscopy (cryo-EM) to determine the structures of human APC/C CDH1:EMI1 and apo-APC/C at 2.9 Å and 3.2 Å, respectively, providing novel insights into the regulation of APC/C activity. The high resolution maps allowed the unambigious assignment of a previously unassigned α-helix to the N-terminus of CDH1 (CDH1 α1 ) in the APC/C CDH1:EMI1 ternary complex. CDH1 α1 binds at the APC1:APC8 interface, thereby interacting with a loop segment of APC1 through electrostatic interactions only provided by CDH1 but not CDC20. We also indentified a novel zinc-binding module in APC2, and confirmed the presence of zinc ions experimentally. Finally, due to the higher resolution and well defined density of these maps we were able to build, aided by AlphaFold predictions, several intrinsically disordered regions in different APC/C subunits that play a fundamental role in proper complex assembly.

The anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) is a large multi-subunit E3 ubiquitin ligase that controls progression through the cell cycle by orchestrating the timely proteolysis of mitotic cyclins and other cell cycle regulatory proteins. Although structures of multiple human APC/C complexes have been extensively studied over the past decade, the S. cerevisiae APC/C has been less extensively investigated. Here, we describe medium resolution structures of three S. cerevisiae APC/C complexes: unphosphorylated apo-APC/C and the ternary APC/C CDH1 -substrate complex, and phosphorylated apo-APC/C. Whereas the overall architectures of human and S. cerevisiae APC/C are conserved, as well as the mechanism of CDH1 inhibition by CDK-phosphorylation, specific variations exist, including striking differences in the mechanism of coactivator-mediated stimulation of E2 binding, and the activation of APC/C CDC20 by phosphorylation. In contrast to human APC/C in which coactivator induces a conformational change of the catalytic module APC2:APC11 to allow E2 binding, in S. cerevisiae apo-APC/C the catalytic module is already positioned to bind E2. Furthermore, we find no evidence of a phospho-regulatable auto-inhibitory segment of APC1, that in the unphosphorylated human APC/C, sterically blocks the CDC20 C-box binding site of APC8. Thus, although the functions of APC/C are conserved from S. cerevisiae to humans, molecular details relating to their regulatory mechanisms differ.