mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) controls transcriptional programs that determine CD8+ cytolytic T cell (CTL) fate. In some cell systems, mTORC1 couples phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) and Akt to the control of glucose uptake and glycolysis. However, PI3K–Akt-independent mechanisms control glucose metabolism in CD8+ T cells, and the role of mTORC1 has not been explored. The present study now demonstrates that mTORC1 activity in CD8+ T cells is not dependent on PI3K or Akt but is critical to sustain glucose uptake and glycolysis in CD8+ T cells. We also show that PI3K- and Akt-independent pathways mediated by mTORC1 regulate the expression of HIF1 (hypoxia-inducible factor 1) transcription factor complex. This mTORC1–HIF1 pathway is required to sustain glucose metabolism and glycolysis in effector CTLs and strikingly functions to couple mTORC1 to a diverse transcriptional program that controls expression of glucose transporters, multiple rate-limiting glycolytic enzymes, cytolytic effector molecules, and essential chemokine and adhesion receptors that regulate T cell trafficking. These data reveal a fundamental mechanism linking nutrient and oxygen sensing to transcriptional control of CD8+ T cell differentiation.

Abstract Natural killer (NK) cells are lymphocytes with important anti-tumour functions. Cytokine activation of NK cell glycolysis and oxidative phosphorylation (OXPHOS) are essential for robust NK cell responses. However, the mechanisms leading to this metabolic phenotype are unclear. Here we show that the transcription factor cMyc is essential for IL-2/IL-12-induced metabolic and functional responses in mice. cMyc protein levels are acutely regulated by amino acids; cMyc protein is lost rapidly when glutamine is withdrawn or when system l -amino acid transport is blocked. We identify SLC7A5 as the predominant system l -amino acid transporter in activated NK cells. Unlike other lymphocyte subsets, glutaminolysis and the tricarboxylic acid cycle do not sustain OXPHOS in activated NK cells. Glutamine withdrawal, but not the inhibition of glutaminolysis, results in the loss of cMyc protein, reduced cell growth and impaired NK cell responses. These data identify an essential role for amino acid-controlled cMyc for NK cell metabolism and function.

Abstract The Immunological Proteome Resource (ImmPRes ; http://immpres.co.uk/ ) is an open access public resource integrating proteomic data generated by large-scale mass-spectrometry analysis of murine hematopoietic populations. The initial focus is T lymphocytes and how their proteomes are shaped by immune activation, environment, and intracellular signalling pathways with an aim to expand it to B cells and innate immune cells. It is a multidisciplinary effort between immunology and mass spectrometry-based labs with the objective to help define an in-depth high-quality map of immune cell proteomes. Maintaining data reproducibility and integrity are a priority within the resource, thus there is an in-depth protocols section explaining in detail the sample processing and the mass spectrometry-based analysis. ImmPRes provides open access to proteomic datasets covering a wide range of murine leukocyte populations with analysis of copy numbers per cell of > 10,000 proteins, enabling new understanding of lymphocyte phenotypes. All data is accessible via a simple graphical interface that supports easy interrogation of the data and options to download data summaries and raw data files.

Abstract Regulatory T (Treg) cells are essential for the maintenance of immunological tolerance, yet the molecular components required for their maintenance and effector functions remain incompletely defined. Inactivation of VPS34 in Treg cells led to an early, lethal phenotype, with massive effector T cell activation and inflammation, like mice lacking Treg cells completely. However, VPS34-deficient Treg cells developed normally, populated the peripheral lymphoid organs and effectively supressed conventional T cells in vitro . Our data suggest that VPS34 is required for the maturation of Treg cells or that mature Treg cells depend on VPS34 for survival. Functionally, we observed that lack of VPS34 activity impairs cargo processing upon transendocytosis, that defective autophagy contributes to, but is not sufficient to explain this lethal phenotype, and that loss of VPS34 activity induces a state of heightened metabolic activity that may interfere with metabolic networks required for maintenance or suppressive functions of Treg cells.

Multiplexing strategies for large-scale proteomic analyses have become increasingly prevalent, TMT in particular. Here we used a large iPSC proteomic experiment with twenty-four 10-plex TMT batches to evaluate the effect of integrating multiple TMT batches within a single analysis. We reveal a significant inflation rate of missing protein and peptide values and show that precision decreases as multiple batches are integrated. Additionally, we explore the effect of false positives using Y chromosome specific peptides as an internal control to quantify the effect of co-isolation interference, as well as primary and secondary reporter ion interference. Based on the results we suggest solutions to mitigate these effects. We show using a reference line can increase precision by normalising the quantification across batches and we propose experimental designs that minimise the effect of cross population reporter ion interference.

Abstract To overcome oxidative, inflammatory, and metabolic stress, cells have evolved networks of cytoprotective proteins controlled by nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2 (Nrf2) and its main negative regulator the Kelch-like ECH associated protein 1 (Keap1). Here, we used high-resolution mass-spectrometry to characterize the proteomes of macrophages with genetically altered Nrf2 status. Our analysis revealed significant differences among the genotypes in cellular metabolism and redox homeostasis, which we validated with respirometry and metabolomics, as well as in anti-viral immune pathways and the cell cycle. Nrf2 status significantly affected the proteome following lipopolysaccharide (LPS) stimulation, with alterations in redox, carbohydrate and lipid metabolism, and innate immunity observed. Of note, Nrf2 activation was found to promote mitochondrial fusion in inflammatory macrophages. The Keap1 inhibitor, 4-octyl itaconate (4-OI), a derivative of the mitochondrial immunometabolite itaconate, remodeled the inflammatory macrophage proteome, increasing redox and suppressing anti-viral immune effectors in a Nrf2-dependent manner. These data suggest that Nrf2 activation facilitates metabolic reprogramming and mitochondrial adaptation, and finetunes the innate immune response in macrophages. Graphical abstract Highlights First high-resolution proteome of macrophages with genetically altered Nrf2 status Nrf2 is key regulator of macrophage redox and intermediary metabolism Nrf2 finetunes the inflammatory response suppressing anti-viral immune and cytokine effectors, whilst promoting T cell activation factors Nrf2 regulates mitochondrial adaptation in inflammatory macrophages promoting the formation of a fused network 4-octyl itaconate (4-OI) suppresses anti-viral immune effectors in inflammatory macrophages in a Nrf2-dependent manner

Abstract Tissue-resident intestinal intraepithelial T lymphocytes (T-IEL) patrol the gut and have important roles in regulating intestinal homeostasis. T-IEL include both induced T-IEL, derived from systemic antigen-experienced lymphocytes, and natural IEL, which are developmentally targeted to the intestine. While the processes driving T-IEL development have been elucidated, the precise roles of the different subsets and the processes driving activation and regulation of these cells remain unclear. To gain functional insights into these enigmatic cells, we used high-resolution, quantitative mass spectrometry to investigate the proteomic landscape of the main T-IEL populations in the gut. Comparing the proteomes of induced T-IEL and natural T-IEL subsets, with naive CD8 + T cells from lymph nodes exposes the dominant effect of the gut environment over ontogeny on T-IEL phenotypes. Analyses of protein copy numbers of >7000 proteins in T-IEL reveal skewing of the cell surface repertoire towards epithelial interactions and checkpoint receptors; strong suppression of the metabolic machinery indicating a high energy barrier to functional activation; and changes in T cell antigen receptor signalling pathways reminiscent of chronically activated T cells. These novel findings illustrate how multiple input signals need to be integrated to regulate T-IEL function.

Integrated analysis using proteomics, RNAseq and polysome profiles revealed a major impact on the proteome caused by erosion of X chromosome inactivation (XCI) in human iPSCs. Low XIST RNA levels were detected in ~40% of iPSC lines from healthy female donors and strongly correlated with erosion of XCI, as evaluated by biallelic expression. Low XIST levels correlated with increased RNA and protein expression from X-linked genes, a ~13% increase in total cell protein content, and significantly increased levels of polysomes, ribosomes and translation factors. Low XIST lines also showed increased protein expression for many autosomal genes, but without a corresponding mRNA increase, producing a major difference in the protein-RNA correlation between genes on either the X chromosome, or autosomes. We conclude that erosion of XCI causes a major remodelling of the proteome, with posttranscriptional mechanisms affecting the expression of a much wider range of proteins and disease-linked gene loci than previously realised.

Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology holds great potential for therapeutic and research purposes. The Human Induced Pluripotent Stem Cell Initiative (HipSci) was established to generate a panel of high-quality iPSCs, from healthy and disease cohorts, with accompanying multi-omics and phenotypic data. Here, we present a proteomic analysis of 217 HipSci iPSC lines obtained from 163 donors. This dataset provides a comprehensive proteomic map of iPSCs, identifying >16,000 protein groups. We analyse how the expression profiles of proteins involved in cell cycle, metabolism and DNA repair contribute to key features of iPSC biology and we identify potential new regulators of the primed pluripotent state. To facilitate access, all these data have been integrated into the Encyclopedia of Proteome Dynamics (www.peptracker.com/epd), where it can be browsed interactively. Additionally, we generated an iPSC specific spectral library for DIA which we deposited in PRIDE along with the raw and processed mass-spectrometry data.

Immune activated T lymphocytes modulate the activity of key metabolic pathways to support the transcriptional reprograming and reshaping of cell proteomes that permits effector T cell differentiation. The present study uses high resolution mass spectrometry and metabolic labelling to explore how T cells control the methionine cycle to produce methyl donors for protein and nucleotide methylations. We show that antigen receptor engagement controls flux through the methionine cycle and also controls RNA and histone methylations. We establish that the main rate limiting step for the methionine cycle is control of methionine transporter expression by antigen receptors. Only T cells that respond to antigen to upregulate and sustain methionine transport are supplied with the methyl donors that permit the dynamic nucleotide methylations and epigenetic reprogramming that drives T cell differentiation.