Structure of SARS-CoV-2 spike in complex with ACE2 reveals the mechanism of ACE2 induced spike conformational transitions.

Abstract The SARS-CoV-2 Omicron variant exhibits striking immune evasion and is spreading globally at an unprecedented speed. Understanding the underlying structural basis of the high transmissibility and greatly enhanced immune evasion of Omicron is of high importance. Here through cryo-EM analysis, we present both the closed and open states of the Omicron spike, which appear more compact than the counterparts of the G614 strain, potentially related to the Omicron substitution induced enhanced protomer-protomer and S1-S2 interactions. The closed state showing dominant population may indicate a conformational masking mechanism of immune evasion for Omicron spike. Moreover, we capture two states for the Omicron S/ACE2 complex with S binding one or two ACE2s, revealing that the substitutions on the Omicron RBM result in new salt bridges/H-bonds and more favorable electrostatic surface properties, together strengthened interaction with ACE2, in line with the higher ACE2 affinity of the Omicron relative to the G614 strain. Furthermore, we determine cryo-EM structures of the Omicron S/S3H3 Fab, an antibody able to cross-neutralize major variants of concern including Omicron, elucidating the structural basis for S3H3-mediated broad-spectrum neutralization. Our findings shed new lights on the high transmissibility and immune evasion of the Omicron variant and may also inform design of broadly effective vaccines against emerging variants.

Abstract The complex eukaryotic chaperonin TRiC/CCT helps maintain cellular protein homeostasis, however, its assembly mechanism remains largely unknown. To address the subunit specificity in TRiC assembly, we express each of the individual yeast TRiC subunit in E. coli . Our cryo-EM structural study and biochemical analyses demonstrate that CCT1/2/6 can form TRiC-like homo-oligomeric double ring (HR) complex, however ATP-hydrolysis cannot trigger their ring closure; after deletion of the long N-terminal extension, CCT5 can form the closed double-ring structure; while CCT3/4/7/8 cannot form the HRs. It appears that CCT1 forms a HR in a unique spiral configuration, and ATP-hydrolysis can drive it to re-assemble with an inserted extra subunit-pair. Our data suggest that CCT5 could be the leading subunit in ATP-hydrolysis-driven TRiC ring closure. Moreover, we demonstrate that ADP is sufficient to trigger the assembly of the HRs and TRiC from the assembly intermediate micro-complex form. Our study reveals that through evolution, the more ancestral subunits may have evolved to take more responsibilities in TRiC ring assembly, and we propose a possible assembly mechanism of TRiC involving subunit-pair insertion. Collectively, our study gives hints on the structural basis of subunit specificity in TRiC assembly and cooperativity, beneficial for future TRiC-related therapeutic strategy development.

Abstract In cryo-electron microscopy (cryo-EM), sample preparation poses a critical bottleneck, particularly for rare or fragile macromolecular assemblies and those suffering from denaturation and particle orientation distribution issues related to air-water interface. In this study, we develop and characterize an immobilized antibody-based affinity grid (IAAG) strategy based on the high-affinity PA tag/NZ-1 antibody epitope tag system. We employ Pyr-NHS as a linker to immobilize NZ-1 Fab on the graphene oxide or carbon-covered grid surface. Our results demonstrate that the IAAG grid effectively enriches PA-tagged target proteins and overcomes preferred orientation issues. Furthermore, we demonstrate the utility of our IAAG strategy for on-grid purification of low-abundance target complexes from cell lysates, enabling atomic resolution cryo-EM. This approach greatly streamlines the purification process, reduces the need for large quantities of biological samples, and addresses common challenges encountered in cryo-EM sample preparation. Collectively, our IAAG strategy provides an efficient and robust means for combined sample purification and vitrification, feasible for high-resolution cryo-EM. This approach holds potential for broader applicability in both cryo-EM and cryo-electron tomography (cryo-ET).

In cryo-electron microscopy (cryo-EM), sample preparation, especially for rare or fragile macromolecular assemblies and those suffering from air-water interface denaturation and particle orientation distribution problems, is a major bottleneck. Here, we developed and characterized an immobilized antibody-based affinity grid (IAAG) strategy based on the high-affinity PA tag/NZ-1 antibody epitope tag system. We used Pyr-NHS as a linker to immobilize NZ-1 Fab on the graphene oxide or carbon covered grid surface. We showed that the IAAG grid can enrich the PA-tagged target proteins, and overcome preferred orientation problems. Furthermore, we demonstrated that our IAAG strategy can be utilized for on-grid purification of low-abundance target complexes from cell lysates and enables atomic resolution cryo-EM. This approach greatly streamlines the purification process, reduces the need for large quantities of biological samples, and addresses common challenges encountered in cryo-EM sample preparation. Collectively, our IAAG strategy provides an efficient and robust means for combined sample purification and vitrification feasible for high-resolution cryo-EM. This approach also has the potential for broader applicability in cryo-EM and cryo-ET.

Abstract The eukaryotic chaperonin TRiC/CCT assists the folding of about 10% of cytosolic proteins through an ATP-driven conformational cycle, and the essential cytoskeleton protein tubulin is the obligate substrate of TRiC. Here, we present an ensemble of cryo-EM structures of human TRiC throughout its ATPase cycle, with three of them revealing endogenously engaged tubulin in different folding stages. Our structural and XL-MS analyses suggested a gradual upward translocation and stabilization of tubulin within the TRiC chamber accompanying TRiC ring closure. Remarkably, in the closed TRiC-tubulin-S3 map resolved to 3.1-Å-resolution, we captured a near-natively folded tubulin. We found the near-natively folded tubulin engaging through its N and C domains mainly with the A and I domains of the CCT3/6/8 subunits through electrostatic and hydrophilic interactions, while the tubulin I domain was found to remain dynamic. Moreover, we also showed the potential role of TRiC C-terminal tails in substrate stabilization and folding. Our study delineates the pathway and molecular mechanism of TRiC-mediated tubulin folding conjugated with TRiC ATPase cycle, and may also inform the design of therapeutic agents targeting TRiC-tubulin interactions.

Abstract The eukaryotic chaperonin TRiC/CCT assists the folding of ~10% cytosolic proteins. The essential cytoskeletal proteins tubulin and actin are the obligate substrates of TRiC and their folding involves cochaperone and co-factors. Here, through cryo-EM analysis, we present a more complete picture of yeast TRiC-assisted tubulin and actin folding in the ATPase-cycle, under the coordination of cochaperone plp2. Our structures revealed that in the open C1 and C2 states, plp2 and substrates tubulin/actin engage with TRiC inside its chamber, one per ring. Noteworthy, we captured a ternary TRiC-plp2-tubulin complex in the closed C3 state, engaged with a full-length β-tubulin in the native folded state even loaded with a GTP, and with a plp2 occupying the opposite ring, not reported before. Another closed C4 state revealed an actin in the intermediate state of folding and a plp2 occupying the other ring. Intriguingly, along with TRiC ring closure, we captured a large translocation of plp2 within TRiC chamber coordinating substrate translocation on the CCT6 hemisphere, potentially facilitating substrate stabilization and folding. Our findings provide structural insights into the folding mechanism of the major cytoskeletal proteins tubulin/actin under the coordination of the complex biogenesis machinery TRiC and plp2, and could extend our understanding on the links between cytoskeletal proteostasis and related human diseases.

Abstract The recent outbreaks of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and its rapid international spread pose a global health emergency. The trimeric spike (S) glycoprotein interacts with its receptor human ACE2 to mediate viral entry into host-cells. Here we present cryo-EM structures of an uncharacterized tightly closed SARS-CoV-2 S-trimer and the ACE2-bound-S-trimer at 2.7-Å and 3.8-Å-resolution, respectively. The tightly closed S-trimer with inactivated fusion peptide may represent the ground prefusion state. ACE2 binding to the up receptor-binding domain (RBD) within S-trimer triggers continuous swing-motions of ACE2-RBD, resulting in conformational dynamics of S1 subunits. Noteworthy, SARS-CoV-2 S-trimer appears much more sensitive to ACE2-receptor than SARS-CoV S-trimer in terms of receptor-triggered transformation from the closed prefusion state to the fusion-prone open state, potentially contributing to the superior infectivity of SARS-CoV-2. We defined the RBD T470-T478 loop and residue Y505 as viral determinants for specific recognition of SARS-CoV-2 RBD by ACE2, and provided structural basis of the spike D614G-mutation induced enhanced infectivity. Our findings offer a thorough picture on the mechanism of ACE2-induced conformational transitions of S-trimer from ground prefusion state towards postfusion state, thereby providing important information for development of vaccines and therapeutics aimed to block receptor binding.