Background: Histone H3 lysine 9 (H3-K9) methylation and DNA methylation are characteristic hallmarks of mammalian heterochromatin. H3-K9 methylation was recently shown to be a prerequisite for DNA methylation in Neurospora crassa and Arabidopsis thaliana. Currently, it is unknown whether a similar dependence exists in mammalian organisms.Results: Here, we demonstrate a physical and functional link between the Suv39h-HP1 histone methylation system and DNA methyltransferase 3b (Dnmt3b) in mammals. Whereas in wild-type cells Dnmt3b interacts with HP1α and is concentrated at heterochromatic foci, it fails to localize to these regions in Suv39h double null (dn) mouse embryonic stem (ES) cells. Consistently, the Suv39h dn ES cells display an altered DNA methylation profile at pericentric satellite repeats, but not at other repeat sequences. In contrast, H3-K9 trimethylation at pericentric heterochromatin is not impaired in Dnmt1 single- or Dnmt3a/Dnmt3b double-deficient ES cells. We also show that pericentric heterochromatin is not transcriptionally inert and can give rise to transcripts spanning the major satellite repeats.Conclusions: These data demonstrate an evolutionarily conserved pathway between histone H3-K9 methylation and DNA methylation in mammals. While the Suv39h HMTases are required to direct H3-K9 trimethylation and Dnmt3b-dependent DNA methylation at pericentric repeats, DNA methylation at centromeric repeats occurs independent of Suv39h function. Thus, our data also indicate a more complex interrelatedness between histone and DNA methylation systems in mammals. Both methylation systems are likely to be important in reinforcing the stability of heterochromatic subdomains and thereby in protecting genome integrity.

Chromatin is important for the regulation of transcription and other functions, yet the diversity of chromatin composition and the distribution along chromosomes are still poorly characterized. By integrative analysis of genome-wide binding maps of 53 broadly selected chromatin components in Drosophila cells, we show that the genome is segmented into five principal chromatin types that are defined by unique yet overlapping combinations of proteins and form domains that can extend over > 100 kb. We identify a repressive chromatin type that covers about half of the genome and lacks classic heterochromatin markers. Furthermore, transcriptionally active euchromatin consists of two types that differ in molecular organization and H3K36 methylation and regulate distinct classes of genes. Finally, we provide evidence that the different chromatin types help to target DNA-binding factors to specific genomic regions. These results provide a global view of chromatin diversity and domain organization in a metazoan cell.

Article27 January 2005free access The profile of repeat-associated histone lysine methylation states in the mouse epigenome Joost HA Martens Joost HA Martens Research Institute of Molecular Pathology (IMP), The Vienna Biocenter, Vienna, Austria Search for more papers by this author Roderick J O'Sullivan Roderick J O'Sullivan Research Institute of Molecular Pathology (IMP), The Vienna Biocenter, Vienna, Austria Search for more papers by this author Ulrich Braunschweig Ulrich Braunschweig Search for more papers by this author Susanne Opravil Susanne Opravil Search for more papers by this author Martin Radolf Martin Radolf Search for more papers by this author Peter Steinlein Peter Steinlein Search for more papers by this author Thomas Jenuwein Corresponding Author Thomas Jenuwein Search for more papers by this author Joost HA Martens Joost HA Martens Research Institute of Molecular Pathology (IMP), The Vienna Biocenter, Vienna, Austria Search for more papers by this author Roderick J O'Sullivan Roderick J O'Sullivan Research Institute of Molecular Pathology (IMP), The Vienna Biocenter, Vienna, Austria Search for more papers by this author Ulrich Braunschweig Ulrich Braunschweig Search for more papers by this author Susanne Opravil Susanne Opravil Search for more papers by this author Martin Radolf Martin Radolf Search for more papers by this author Peter Steinlein Peter Steinlein Search for more papers by this author Thomas Jenuwein Corresponding Author Thomas Jenuwein Search for more papers by this author Author Information Joost HA Martens1, Roderick J O'Sullivan1, Ulrich Braunschweig, Susanne Opravil, Martin Radolf, Peter Steinlein and Thomas Jenuwein 1Research Institute of Molecular Pathology (IMP), The Vienna Biocenter, Vienna, Austria ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. Research Institute of Molecular Pathology (IMP), The Vienna Biocenter, Dr Bohrgasse 7, 1030 Vienna, Austria. Tel.: +43 1 797 30 474; Fax: +43 1 798 7153; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2005)24:800-812https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600545 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Histone lysine methylation has been shown to index silenced chromatin regions at, for example, pericentric heterochromatin or of the inactive X chromosome. Here, we examined the distribution of repressive histone lysine methylation states over the entire family of DNA repeats in the mouse genome. Using chromatin immunoprecipitation in a cluster analysis representing repetitive elements, our data demonstrate the selective enrichment of distinct H3-K9, H3-K27 and H4-K20 methylation marks across tandem repeats (e.g. major and minor satellites), DNA transposons, retrotransposons, long interspersed nucleotide elements and short interspersed nucleotide elements. Tandem repeats, but not the other repetitive elements, give rise to double-stranded (ds) RNAs that are further elevated in embryonic stem (ES) cells lacking the H3-K9-specific Suv39h histone methyltransferases. Importantly, although H3-K9 tri- and H4-K20 trimethylation appear stable at the satellite repeats, many of the other repeat-associated repressive marks vary in chromatin of differentiated ES cells or of embryonic trophoblasts and fibroblasts. Our data define a profile of repressive histone lysine methylation states for the repetitive complement of four distinct mouse epigenomes and suggest tandem repeats and dsRNA as primary triggers for more stable chromatin imprints. Introduction Over the last years, the genome sequencing of several model organisms revealed that mammals, as compared to unicellular organisms or invertebrates, have a highly complex genome organization, largely resulting from the accumulation of repetitive elements and noncoding sequences (Lander et al, 2001; Waterston et al, 2002). In mouse, such elements account for the majority of its DNA content (44% repetitive and 52% noncoding), whereas only 4% encodes for protein function. As a result, most mammalian genes are disrupted with long intervening sequences that often also contain interspersed repeats. Since the pioneering work of Muller (1930) and McClintock (1951), nonspecific or repetitive sequences have been thought of as 'epigenetic elements' that can modulate gene expression programmes and also organize heterochromatic domains at centromeres and telomeres (Pardue and Gall, 1970). These repetitive elements range from short interspersed transposable elements to large centromere-associated and telomeric arrays of DNA (Waterston et al, 2002). Although the clustering of repetitive elements in large segments contributes to specialized structures in pericentric heterochromatin, most of the repetitive elements pose an inherent burden to genome stability, as their mobilization facilitates recombination between nonhomologous loci, leading to chromosomal deletions and translocations (Kazazian, 2004). Multicellular organisms have developed silencing mechanisms to prevent remobilization of transposons. These include RNAi-triggered silencing (Ratcliff et al, 1997; Mette et al, 2000; Vastenhouw and Plasterk, 2004), DNA methylation (Jaenisch and Bird, 2003; Bourc'his and Bestor, 2004) and histone modifications (Jenuwein and Allis, 2001). Current data have given rise to models in which transcription across DNA repeats would induce formation of double-stranded RNA (dsRNA), which in turn recruits repressive chromatin modifications and DNA methylation to the underlying chromatin template (Tamaru and Selker, 2001; Hall et al, 2002; Volpe et al, 2002; Chan et al, 2004; Lippman and Martienssen, 2004; Verdel et al, 2004). Recent mapping studies across large chromosome regions revealed a strong correlation between DNA repeats, noncoding RNA, histone H3 lysine 9 methylation and DNA methylation (Lippman et al, 2004). Similarly, transcription factor mapping along human chromosomes (Cawley et al, 2004) indicated that these factors are not only found at promoters, but also can be identified at noncoding regions. There are three repressive histone lysine methylation marks (H3-K9, H3-K27 and H4-K20) and three distinct methylation states (mono-, di- and trimethylation). H3-K9 trimethylation (Peters et al, 2003) and H4-K20 trimethylation (Schotta et al, 2004) are concentrated at pericentric and centric heterochromatin (Lehnertz et al, 2003). By contrast, H3-K27 trimethylation is enriched at the inactive X chromosome (Plath et al, 2003; Silva et al, 2003; Kohlmaier et al, 2004). Although this chromosome has the highest density of DNA repeats, the contribution of these repeats in X-chromosome inactivation remains unclear. Similarly, H3-K27 trimethylation has been implicated in Polycomb-dependent gene silencing (Ringrose and Paro, 2004) via Polycomb response elements (PREs), which also contain short repetitive elements (Ringrose et al, 2003). Despite these parallels, it is largely unknown whether the same or different histone lysine methylation marks are recruited to large arrays or to interspersed repeats and whether these epigenetic states are stably inherited across distinct cell types. Chromatin modifications have been shown to be highly dynamic at heterochromatin during differentiation (O'Neill and Turner, 1995), and recent data indicated significant differences in occupancy of transcription factor binding in a genome-wide analysis in Saccharomyces cerevisiae comparing various transcriptional states (Harbison et al, 2004). Here, we analysed the distribution of all nine repressive histone methylation states (H3-K9, H3-K27, H4-K20 mono-, di- and trimethylation) across the repetitive complement of the mouse genome. Using directed and array-based chromatin immunoprecipitation (ChIP), we compared tandem satellite repeats (pericentric and centric heterochromatin) with distinct families of interspersed repeats including DNA transposons, long terminal repeats (LTRs), long interspersed nucleotide elements (LINEs) and short interspersed nucleotide elements (SINEs). We detect distinct chromatin modification patterns between tandem and the various interspersed repeats, which are further reflected by differences in the noncoding and dsRNAs that are generated from these elements. In addition, the observed repeat-associated histone lysine methylation profiles display significant variability in chromatin of different cell types (e.g. embryonic stem (ES) cells, fibroblasts and trophoblasts). Together, our data provide a representative cluster analysis for repressive chromatin modifications of the repetitive part of four distinct mouse epigenomes. Results Cluster analysis of repetitive elements Mouse chromosomes are acrocentric and contain cytologically visible heterochromatin around their centromeres (Figure 1A). This constitutive heterochromatin can be subdivided into domains of tandem arrays of A/T-rich major satellite repeats that can comprise ⩾10 000 copies of a 234 base-pair (bp) unit per pericentric region. Similarly, centric heterochromatin (the primary constriction) consists of tandem arrays of ∼2000 copies of 123 bp minor satellite repeats. Both major and minor satellite repeats account for ∼3.5% of the mammalian genome (Lander et al, 2001; Waterston et al, 2002) (Figure 1B). Figure 1.Overview of repetitive elements in the mouse genome. (A) Schematic diagram of a mitotic mouse chromosome illustrating the distribution of major (pericentric) and minor (centromeric) satellite repeats and of the various interspersed repetitive elements. (B) Summary description of repeat classes, highlighting repeat organization, length, copy number and overall abundance in the mouse genome. Specific primers (black arrows) were designed to generate PCR fragments from within the repetitive elements, thereby allowing a cluster analysis that detects the sum of chromatin modifications for a given repeat class. The sequences of these primers are indicated in Supplementary data. Although the entire repeat units are shown, most repetitive elements in the mouse genome are not full length (Waterston et al, 2002). Download figure Download PowerPoint Interspersed repeats are singular repetitive elements that are integrated over the entire genome. Around 1% of interspersed repeats are DNA transposons (e.g. Mariner, Tigger, URR1 and Charlie), which are inactive remnants of a mutated DNA transposase element (Kazazian, 2004). The most abundant class of interspersed repeats is represented by different subtypes of retro- or RNA transposons, which together account for 25% of the mouse genome. Subclass I are the LTR transposons, including the highly active intracesternal A particle (IAP) elements. These resemble retroviruses and are associated with over 10% of all spontaneous mutations in mice (Waterston et al, 2002). Subclass II are non-LTR transposons or LINE (or L1) elements, which form the single largest fraction (∼19%) of interspersed repeats in the mouse. It has been estimated that between 0.5 and 1% of LINEs are potentially active (Goodier et al, 2001). Subclass III are SINEs, which can be further subdivided into SINE B1, the human counterpart of which are Alu elements, B2 and RSINEs. SINEs are nonautonomous elements and are thought to rely on LINEs for retrotransposition (Smit, 1996). For all of these distinct repeat classes, specific primers for ChIP analyses were designed, which will generate, on average, 200 bp fragments from within each repetitive unit or over the LTR and UTR segments of the various transposons (see Figure 1B). Although this strategy will not allow measurement of potential differences in repeat-associated chromatin modifications that may be present at various chromosomes and cannot discriminate solitary copies of interspersed repeats, it offers a solid cluster analysis of chromatin at DNA repeats, which gauges the sum of a given histone modification over these distinct repetitive elements. The profile of repressive histone lysine methylation states at distinct repeat classes Lysates of crosslinked chromatin from wild-type (wt) and Suv39h double null (dn) mouse ES cells were sonicated to generate fragments of approximately 300–1500 bp. Chromatin fragments were analysed by DNA blot to confirm representation of DNA repeats (see Supplementary Figure S1). The sonicated lysates were then used in ChIP with our panel of H3-K9, H3-K27 and H4-K20 antibodies. Precipitated DNA was analysed by real-time PCR with the repeat-specific primer sets (see Figure 1B). As controls, we included primers for ribosomal DNA, actin and tubulin and also performed ChIP with an active mark, histone H3-K4 trimethylation (Santos-Rosa et al, 2002). Based on these control ChIP, we observed that most modifications show a dispersed, basal level signal, which remained below 0.5% of precipitated material (Figure 2, bottom panels). We therefore applied the 0.5% threshold to evaluate accumulation of distinct histone lysine methylation marks across repetitive elements. Figure 2.Cluster analysis for repeat-associated histone lysine methylation states. ChIP of wt and Suv39h dn ES cell chromatin with antibodies detecting H3-K9, H3-K27 and H4-K20 mono-, di- and trimethylation. As controls, ChIP was also performed with H3-K4 trimethyl (an active mark) antibodies and for the tubulin gene. Purified DNA from enriched chromatin fragments was amplified by real-time PCR with the repeat-specific primer sets (see Figure 1B), and values are indicated as percentage precipitation relative to the input. The dashed line represents the threshold signal of 0.5%, above which significant enrichment for distinct histone lysine methylation states was scored. Download figure Download PowerPoint Using this threshold, we observe selective enrichment for H3-K9 tri-, H3-K27 mono- and H4-K20 trimethylation across mouse major and minor satellite repeats as previously reported (Peters et al, 2003; Schotta et al, 2004). This enrichment of H3-K9 trimethylation was not detected at human centromeric chromatin (Sullivan and Karpen, 2004). Similar to the apparent under-representation of H3-K9 trimethylation in Drosophila (Ebert et al, 2004) or Arabidopsis thaliana (Jackson et al, 2004) heterochromatin, species-specific alterations in satellite composition could account for these differences. For both major and minor satellites, the trimethyl marks are significantly impaired in the control ChIP with chromatin from Suv39h dn ES cells (Figure 2). DNA transposons, exemplified by Mariner and Charlie, are also enriched for H3-K9 trimethylation in a Suv39h-dependent manner. In addition, DNA transposons also contain H4-K20 dimethylation as a second signature mark, although this profile is not consistently associated with different members of DNA transposons, such as, for example, Tigger and URR1 (data not shown). For IAP LTRs, we detect H4-K20 trimethylation as the sole prominent mark. Since only a modest reduction in the level of H4-K20 trimethylation is observed in Suv39h dn chromatin, establishment of this mark is probably independent of the Suv39h enzymes and may occur in a mechanism that is distinct from the induction of H4-K20 trimethylation at pericentric heterochromatin (Schotta et al, 2004). For LINEs, hardly any signals are detectable above threshold (e.g. H3-K9 tri- and H4-K20 trimethylation are marginal). Similarly, although SINEs can be identified by H3-K27 mono- and dimethylation, these marks are significantly less pronounced as compared to the prominent histone lysine methylation imprints at the satellite repeats, the DNA and IAP retrotransposons. Since our cluster analysis gauges the average enrichment of histone methylation marks in a chromatin environment, these low-level signals do not exclude that there may be enriched modifications at some solitary LINE or SINE repeats. It also remained possible that the repeat-associated histone methylation profiles would not reflect their representation over the coding regions of the IAP LTR and LINE elements. We therefore used additional primer pairs that are around 1.6 kb (IAPgag) or 3.1 kb (L1 ORF2) distal from the terminal repeats (see Figure 1B), and confirmed enrichment of H4-K20 trimethylation across IAP LTR transposons or absence of significant methylation marks within the LINE L1 element (Figure 2). In addition to the directed ChIP, we also generated a custom-made microarray that is specific for all the above repeat classes in the mouse genome. PCR fragments were generated using the primer sets indicated in Figure 1B, and amplified sequences were spotted in quadruplicate on glass slides, which were then probed with ChIP material from wt and Suv39h dn ES cells. These ChIP-on-chip experiments (data not shown) are consistent with the above results of the directed ChIP (Figure 2). Reduced DNA methylation does not alter repressive histone lysine methylation profiles To examine whether DNA methylation would affect the observed histone lysine methylation profiles, we repeated the directed ChIP with ES cells that are wt (J1) or mutant for DNA methyltransferase (DNMT) Dnmt1 and double mutant for the DNMTs Dnmt3a and Dnmt3b (Okano et al, 1999). Genomic DNA was cleaved with the restriction enzyme McrBC, which selectively digests methylated DNA. The resulting DNA fragments were used in PCR amplifications with the same primer sets as indicated in Figure 1B to estimate the relative distribution of DNA methylation (Rabinowicz et al, 2003) (Figure 3, lanes indicated 5mC). This analysis reveals high levels of DNA methylation at IAP LTRs, moderate DNA methylation at major and minor satellite repeats and at LINEs, and low DNA methylation at DNA transposons and SINEs. Importantly, all of these DNA methylation levels are significantly reduced in the mutant Dnmt1 and Dnmt3a/Dnmt3b backgrounds. Figure 3.Repeat-associated H3-K9, H3-K27 and H4-K20 methylation states in chromatin of Dnmt-deficient ES cells. ChIP profile of wt (J1), Dnmt1-/- and Dnmt3ab-/- ES cell chromatin as described in Figure 2. Also indicated is the degree of DNA methylation (5mC) that is present at the distinct repeat classes in wt and mutant Dnmt chromatin. For this analysis, genomic DNA was digested with the methylation-specific restriction enzyme McrBC, and relative DNA methylation was measured by the inverse ability of the remaining DNA fragments to generate PCR products (Rabinowicz et al, 2003) with the repeat-specific primer sets (see Figure 1B). Download figure Download PowerPoint We then analysed the repressive histone lysine methylation profile in chromatin of J1 and the Dnmt mutant ES cells. This indicated a very similar, although slightly less pronounced, pattern of the marks across repetitive elements as compared to the data described in Figure 2. Importantly, we did not observe significant differences between J1 and Dnmt mutant chromatin, suggesting that impaired DNA methylation in ES cells does not significantly alter the observed histone lysine methylation pattern. It is, however, possible that in chromatin fully deficient for all DNMTs, a more dramatic alteration of repeat-associated histone lysine methylation may be induced. Repeat-associated transcript levels are elevated in Suv39h dn ES cells To determine the transcriptional status of the different repeat classes, we performed reverse transcription (RT–PCR) on total RNA that was isolated from wt and Suv39h dn ES cells (Figure 4A). Transcriptional activity of satellite repeats has been described (Rudert et al, 1995), and previous studies have indicated transcripts across major and minor satellites at elevated (35) PCR cycles (Lehnertz et al, 2003). Here, real-time PCR with the primer sets indicated in Figure 1B was used to calibrate linear range (22–27) PCR cycles (see Supplementary Figure S2) for visualization of transcripts. Figure 4.Elevated transcript levels for repetitive DNA elements in Suv39h dn ES cells. RT–PCR analysis for repeat-derived transcript levels in total RNA from wt and Suv39h dn ES cells (A) or from wt (J1) and Dnmt1-/- or Dnmt3ab-/- ES cells (B). cDNA was generated by random priming and then amplified with the repeat-specific primer sets (see Figure 1B). Linear range amplification of cDNA was calibrated by real-time PCR (between 22 and 27 cycles; see Supplementary Figure S2), and PCR products are visualized by inverse images of EtBr-stained 2% agarose gels. As controls, reactions were performed without reverse transcriptase (−RT). The relative average increase in transcription of two distinct elements within a repeat class is indicated in the middle of the two columns shown in panel A. Download figure Download PowerPoint The data indicate that for all repeat classes, transcripts can be detected (Figure 4A), although the cluster analysis does not allow measurement of transcriptional activity for individual repeats. In Suv39h dn ES cells, transcripts are significantly increased (up to five-fold) for major and minor satellite repeats and for IAP LTRs, and modestly elevated (∼2-fold) for DNA transposons, LINEs and SINEs. Surprisingly, there is also a five-fold increase for rDNA transcripts in the Suv39h dn ES cells. Together, these data reflect higher transcript levels in Suv39h dn ES cells for all of the analysed repeats. By contrast, no apparent difference in the abundance of repeat-associated transcripts was detected in the comparative RNA analysis with total RNA from Dnmt1 and Dnmt3a/Dnmt3b mutant ES cells (Figure 4B). The tandem satellite repeats generate dsRNA To examine whether the quality and nature of RNA transcripts may differ between tandem and interspersed repeats, we used enzymes that preferentially cleave either single-stranded (ss) (RNAseONE) or dsRNA (RNAseV1). First, a titration experiment was performed to determine the optimal digestion time. Total RNA from wt ES cells was incubated for different times with RNAseONE or RNAseV1, and the remaining RNA molecules were analysed by real-time RT–PCR with primers for major satellites and tubulin. The generated signal was compared to reactions with undigested RNA, which was set at 100% (see Supplementary Figure S3). Thus, this analysis does not measure total abundance of RNA as shown in Figure 4, but rather indicates the relative presence of ds or ss transcripts in the remaining pool of digested RNA. A 30 s digest with RNAseONE was used to remove ssRNAs. At this time point, ∼22% of major satellite transcripts are left (see Supplementary Figure S3). This remaining pool of dsRNA was then analysed with the repeat-specific primer sets. We observed significant signal for major and minor satellite repeats, whereas very little or no dsRNA could be detected for any of the interspersed repeats. Importantly, the dsRNAs for major and minor satellite repeats are significantly upregulated in Suv39h dn cells (Figure 5A). Figure 5.Tandem satellite repeats generate dsRNA. Total RNA from wt and Suv39h dn ES cells was treated for the indicated time points with RNAseONE™ to digest ssRNAs (A) or with RNAseV1 to cleave dsRNAs (B). The remaining pool of RNA molecules was then converted to cDNA and amplified by real-time PCR with the repeat-specific primer sets (see Figure 1B). The histograms indicate the percentages, relative to undigested RNA, of repeat-derived RT–PCR products that can be generated after RNAseONE™ (% dsRNA) or RNAseV1 (% ssRNA) treatment. Download figure Download PowerPoint A 2 min digest with RNAseV1 was used to remove dsRNA. At this time point, ∼50% of tubulin transcripts are still present, whereas <2% of major satellite RNAs are left (see Supplementary Figure S3). The remaining pool of ssRNA was then analysed with the repeat-specific primer sets. Very low levels of ssRNA for the tandem repeats (major and minor) were detected, but there are significant transcripts for DNA transposons, retrotransposons, LINEs and SINEs (Figure 5B). With the exception of the DNA transposon Charlie, SINE B2 elements and rDNA, the levels of ss transcripts are not reduced for the other interspersed repeats in RNA preparations from Suv39h dn cells. Together, the results indicate that tandem repeats favour the generation of ds transcripts, whereas interspersed repeats primarily generate ss transcripts. Moreover, since ds transcripts are significantly elevated in Suv39h dn cells, the data further suggest a function for the Suv39h histone methyltransferases (HMTases) in processing or stabilization of ds transcripts complementary to the major and minor satellite repeats. Expression of repeat-associated transcripts in four distinct epigenomes So far, we have analysed repeat-associated histone lysine methylation profiles in only one chromatin environment, ES cells. The question arises as to how stable these modifications are in different cell types. To expand our analysis, we treated ES cells with all-trans-retinoic acid (RA) to form embryoid bodies, thereby generating a retinoic-acid differentiated ES cell population (RA-ES). In addition, we also used day 13.5 mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and a trophoblast stem (TS) cell line (Tanaka et al, 1998) (Figure 6A, top panels). The different character of these four distinct cell populations was confirmed by RT–PCR marker analysis for Oct-4 (ES cells), Cdx-2 (TS cells) and Annexin-5 (MEFs) (see Supplementary Figure S4). We also examined expression profiles of the major enzymatic systems transducing H3-K9 trimethylation (Suv39h1, Suv39h 2), H4-K20 trimethylation (Suv4-20h1, Suv4-20h2), H3-K27 trimethylation (Ezh1, Ezh2) and 'euchromatic' H3-K9 dimethylating enzymes, such as G9a, Glp1, Eset and Cll8. All of these HMTases are broadly expressed in ES cells and MEFs, whereas some are downregulated in TS cells (see Supplementary Figure S4). Figure 6.Repeat-associated transcript levels in four distinct mouse epigenomes. (A) Images of cultured mouse ES cells, RA-ES cells, day 13.5 MEFs and TS cells. (B) RT–PCR analyses for repeat-derived transcript levels in the four distinct cell populations. Total RNA was converted into cDNA, which was then amplified by real-time PCR with the repeat-specific primer sets (see Figure 1B). The histogram indicates the relative difference (after normalization for tubulin expression) in the abundance of repeat-derived transcripts with respect to levels observed in wt ES cells (see Figure 4 and Supplementary Figure S2), which were set at 1. Download figure Download PowerPoint We then extended the RT–PCR analysis and examined the presence of repeat-associated transcripts in total RNA preparations from all four different cell populations. For comparison, wt ES cell transcripts for each given repeat class (data from Figure 4 and Supplementary Figure 2) were set at 1, and their relative increase or decrease in the other cell populations was determined. Transcript levels for major satellite repeats are significantly increased upon RA induction, and levels of both major and minor transcripts are high in ES cells and MEFs (Figure 6B). Transcripts for LINEs are also selectively elevated (∼2.5-fold) in MEFs. Across the various cell populations, major satellite and LINE transcripts are most highly abundant, suggesting a potential role for increased transcription of these repeats during differentiation. By contrast, transcripts from DNA and IAP LTR transposons are downregulated, as is rDNA transcription, while SINE-derived RNA levels vary among the four different cell types. In general, transcript levels for all repeat classes are very low in TS cells. This low abundance has been confirmed with total RNA preparations from a different TS cell line that was generated by outgrowth from Bl6/Sv129 blastocysts (data not shown). Stability of repressive histone lysine methylation marks at tandem repeats To compare the repeat-associated histone lysine methylation profile among the various cell types, we spiked samples with Drosophila S2 chromatin and again used a threshold of 0.5%. This internal standard resulted in a different calibration of material precipitated from ES and RA-ES cells (4%) versus MEFs and TS cells (2%), as indicated in Figure 7. Although we used our full panel of antibodies as shown in Figure 2, we only summarize the data where we have observed informative differences and signals surpassing the 0.5% threshold (H3-K9 tri-, H3-K27 mono- and di-, and H4-K20 di- and trimethylation). In chromatin of ES cells, major and minor satellites are enriched for H3-K9 tri-, H3-K27 mono- and H4-K20 trimethylation (Figure 7, top panels). After RA differentiation, the sum of these marks is elevated and both tandem repeats gain significant signal for H4-K20 dimethylation. In chromatin of MEFs and TS cells, the profile of histone lysine methylation at major and minor satellite repeats resembles that of undifferentiated ES cells, with minor differences for reduced definition of H3-K27 mono- and H4-K20 trimethylation in MEFs or of H3-K27 monomethylation in TS cells. These data indicate that the pattern of repressive histone lysine methylation states (particularly the combination of H3-K9 tri- and H4-K20 trimethylation) across tandem satellite repeats is largely maintained in chromatin of different cell types. Figure 7.Stability of repressive histone lysine methylation marks at tandem but not at interspersed repeats. ChIP profile for repeat-associated histone lysine methylation states in wt chromatin of ES cells, RA-ES cells, MEFs and TS cells. The dashed line represents the threshold signal of 0.5%, above which significant enrichment for distinct histone lysine methylation states was scored. To adjust for differences in the ChIP efficien

Alternative splicing (AS) of precursor RNAs is responsible for greatly expanding the regulatory and functional capacity of eukaryotic genomes. Of the different classes of AS, intron retention (IR) is the least well understood. In plants and unicellular eukaryotes, IR is the most common form of AS, whereas in animals, it is thought to represent the least prevalent form. Using high-coverage poly(A)(+) RNA-seq data, we observe that IR is surprisingly frequent in mammals, affecting transcripts from as many as three-quarters of multiexonic genes. A highly correlated set of cis features comprising an "IR code" reliably discriminates retained from constitutively spliced introns. We show that IR acts widely to reduce the levels of transcripts that are less or not required for the physiology of the cell or tissue type in which they are detected. This "transcriptome tuning" function of IR acts through both nonsense-mediated mRNA decay and nuclear sequestration and turnover of IR transcripts. We further show that IR is linked to a cross-talk mechanism involving localized stalling of RNA polymerase II (Pol II) and reduced availability of spliceosomal components. Collectively, the results implicate a global checkpoint-type mechanism whereby reduced recruitment of splicing components coupled to Pol II pausing underlies widespread IR-mediated suppression of inappropriately expressed transcripts.

Alternative splicing (AS) generates remarkable regulatory and proteomic complexity in metazoans. However, the functions of most AS events are not known, and programs of regulated splicing remain to be identified. To address these challenges, we describe the Vertebrate Alternative Splicing and Transcription Database (VastDB), the largest resource of genome-wide, quantitative profiles of AS events assembled to date. VastDB provides readily accessible quantitative information on the inclusion levels and functional associations of AS events detected in RNA-seq data from diverse vertebrate cell and tissue types, as well as developmental stages. The VastDB profiles reveal extensive new intergenic and intragenic regulatory relationships among different classes of AS and previously unknown and conserved landscapes of tissue-regulated exons. Contrary to recent reports concluding that nearly all human genes express a single major isoform, VastDB provides evidence that at least 48% of multiexonic protein-coding genes express multiple splice variants that are highly regulated in a cell/tissue-specific manner, and that >18% of genes simultaneously express multiple major isoforms across diverse cell and tissue types. Isoforms encoded by the latter set of genes are generally coexpressed in the same cells and are often engaged by translating ribosomes. Moreover, they are encoded by genes that are significantly enriched in functions associated with transcriptional control, implying they may have an important and wide-ranging role in controlling cellular activities. VastDB thus provides an unprecedented resource for investigations of AS function and regulation.

Summary H2A.Z mono-ubiquitylation has been linked to transcriptional repression, but the mechanisms involved are not well understood. To address this, we developed a biotinylation-based approach to purify ubiquitylated H2A.Z (H2A.Zub) mononucleosomes for biochemical and genome-wide analyses. We observe that H2A.Zub nucleosomes are enriched for the repressive histone post-translational modification H3K27me3, but depleted of H3K4 methylation and other modifications associated with active transcription. ChIP-Seq analyses reveal that H2A.Zub-nucleosomes are enriched over non-expressed genes, and suggest that it is the relative ratio of ubiquitylated to non-ubiquitylated H2A.Z, rather than absolute presence or absence of H2A.Z ubiquitylation, that correlates with gene silencing. Finally, we observe that H2A.Zub-eniched mononucleosomes preferentially co-purify with transcriptional silencing factors as well as proteins involved in higher order chromatin organization such as CTCF and cohesin. Collectively, these results suggest an important role for H2A.Z ubiquitylation in mediating global transcriptional repression through its recruitment of silencing factors and nuclear architectural proteins.

ABSTRACT Alternative splicing is critical for development; however, its role in the specification of the three embryonic germ layers is poorly understood. By performing RNA-Seq on human embryonic stem cells (hESCs) and derived definitive endoderm, cardiac mesoderm, and ectoderm cell lineages, we detect distinct alternative splicing programs associated with each lineage. The most prominent splicing program differences are observed between definitive endoderm and cardiac mesoderm. Integrative multi-omics analyses link each program with lineage-enriched RNA binding protein regulators, and further suggest a widespread role for Quaking (QKI) in the specification of cardiac mesoderm. Remarkably, knockout of QKI disrupts the cardiac mesoderm-associated alternative splicing program and formation of myocytes. These changes arise in part through reduced expression of BIN1 splice variants linked to cardiac development. Mechanistically, we find that QKI represses inclusion of exon 7 in BIN1 pre-mRNA via an exonic ACUAA motif, and this is concomitant with intron removal and cleavage from chromatin. Collectively, our results uncover alternative splicing programs associated with the three germ lineages and demonstrate an important role for QKI in the formation of cardiac mesoderm.

Abstract Cys2His2 (C2H2) type zinc finger (ZnF) proteins constitute a large class of proteins that are generally considered to be DNA-binding transcription factors. Using affinity purification followed by mass spectrometry, as well as reciprocal co-immunoprecipitation experiments, we determined that the C2H2-ZnF protein Znf684 interacts physically with several proteins involved in mRNA export, including Nxf1 and Alyref. We utilized individual nucleotide resolution cross-linking immunoprecipitation followed by high throughput sequencing (iCLIP-seq) experiments to show that Znf684 binds directly to specific mRNAs in vivo and has an RNA-binding profile similar to those of Nxf1 and Alyref, suggesting a role in mRNA export regulation. Immunofluorescence microscopy (IF) experiments revealed that Znf684 localizes to both the nucleus and cytoplasm. Using cellular fractionation experiments, we demonstrate that overexpression of Znf684 negatively impacts the export of SMAD3 and other target mRNAs. Taken together, our results suggest that Znf684 regulates the export of a subset of transcripts through physical interactions with Nxf1 and specific target mRNAs.

Abstract Disruption of alternative splicing frequently causes or contributes to human diseases and disorders. Consequently, there is a need for efficient and sensitive reporter assays capable of screening chemical libraries for compounds with efficacy in modulating important splicing events. Here, we describe a screening workflow employing dual Nano and Firefly luciferase alternative splicing reporters that affords efficient, sensitive, and linear detection of small molecule responses. Applying this system to a screen of ~95,000 small molecules identified compounds that stimulate or repress the splicing of neuronal microexons, a class of alternative exons often disrupted in autism and activated in neuroendocrine cancers. One of these compounds rescues the splicing of several analyzed microexons in the cerebral cortex of an autism mouse model haploinsufficient for Srrm4, a major activator of brain microexons. We thus describe a broadly applicable high-throughput screening system for identifying candidate splicing therapeutics, and a resource of small molecule modulators of microexons with potential for further development in correcting aberrant splicing patterns linked to human disorders and disease.

Abstract N6-methyladenosine (m6A), the most abundant internal modification on eukaryotic mRNA, and N6, 2′-O-dimethyladenosine (m6Am), are epitranscriptomic marks that function in multiple aspects of posttranscriptional regulation. Fat mass and obesity-associated protein (FTO) can remove both m 6 A and m6Am; however, little is known about how FTO achieves its substrate selectivity. Here, we demonstrate that ZBTB48, a C2H2-zinc finger protein that functions in telomere maintenance, associates with FTO and binds both mRNA and the telomere-associated regulatory RNA TERRA to regulate the functional interactions of FTO with target transcripts. Specifically, depletion of ZBTB48 affects targeting of FTO to sites of m6A/m6Am modification, changes cellular m6A/m6Am levels and, consequently, alters decay rates of target RNAs. ZBTB48 ablation also accelerates growth of HCT-116 colorectal cancer cells and modulates FTO- dependent regulation of Metastasis-associated protein 1 (MTA1) transcripts by controlling the binding to MTA1 mRNA of the m6A reader IGF2BP2. Our findings thus uncover a previously unknown mechanism of posttranscriptional regulation in which ZBTB48 co-ordinates RNA- binding of the m6A/m6Am demethylase FTO to control expression of its target RNAs.