LP
Luca Pinello
Author with expertise in Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated proteins
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
53
(66% Open Access)
Cited by:
4,662
h-index:
46
/
i10-index:
94
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis

Matthew Canver et al.Sep 16, 2015
Enhancers, critical determinants of cellular identity, are commonly recognized by correlative chromatin marks and gain-of-function potential, although only loss-of-function studies can demonstrate their requirement in the native genomic context. Previously, we identified an erythroid enhancer of human BCL11A, subject to common genetic variation associated with the fetal haemoglobin level, the mouse orthologue of which is necessary for erythroid BCL11A expression. Here we develop pooled clustered regularly interspaced palindromic repeat (CRISPR)-Cas9 guide RNA libraries to perform in situ saturating mutagenesis of the human and mouse enhancers. This approach reveals critical minimal features and discrete vulnerabilities of these enhancers. Despite conserved function of the composite enhancers, their architecture diverges. The crucial human sequences appear to be primate-specific. Through editing of primary human progenitors and mouse transgenesis, we validate the BCL11A erythroid enhancer as a target for fetal haemoglobin reinduction. The detailed enhancer map will inform therapeutic genome editing, and the screening approach described here is generally applicable to functional interrogation of non-coding genomic elements. A CRISPR-Cas9 approach is used to perform saturating mutagenesis of the human and mouse BCL11A enhancers, producing a map that reveals critical regions and specific vulnerabilities; BCL11A enhancer disruption is validated by CRISPR-Cas9 as a therapeutic strategy for inducing fetal haemoglobin by applying it in both mice and primary human erythroblast cells. BCL11A is a transcriptional repressor that inhibits expression of fetal globin genes in adults, and is a potential therapeutic target for the treatment of β-globinopathies such as β-thalassemia and sickle cell disease. The enhancer of BCL11A is subject to common genetic variation associated with fetal hemoglobin level. Here, Daniel Bauer and colleagues use a CRISPR–Cas9 approach to perform saturation mutagenesis of the human and mouse BCL11A enhancers, producing a map that reveals critical regions and specific vulnerabilities. They validate BCL11A enhancer disruption by CRISPR–Cas9 as a therapeutic strategy for inducing fetal haemoglobin by applying it in both mice and primary human erythroblast cells.
0
Citation781
0
Save
0

Engineered CRISPR–Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing

Benjamin Kleinstiver et al.Feb 11, 2019
Broad use of CRISPR–Cas12a (formerly Cpf1) nucleases1 has been hindered by the requirement for an extended TTTV protospacer adjacent motif (PAM)2. To address this limitation, we engineered an enhanced Acidaminococcus sp. Cas12a variant (enAsCas12a) that has a substantially expanded targeting range, enabling targeting of many previously inaccessible PAMs. On average, enAsCas12a exhibits a twofold higher genome editing activity on sites with canonical TTTV PAMs compared to wild-type AsCas12a, and we successfully grafted a subset of mutations from enAsCas12a onto other previously described AsCas12a variants3 to enhance their activities. enAsCas12a improves the efficiency of multiplex gene editing, endogenous gene activation and C-to-T base editing, and we engineered a high-fidelity version of enAsCas12a (enAsCas12a-HF1) to reduce off-target effects. Both enAsCas12a and enAsCas12a-HF1 function in HEK293T and primary human T cells when delivered as ribonucleoprotein (RNP) complexes. Collectively, enAsCas12a provides an optimized version of Cas12a that should enable wider application of Cas12a enzymes for gene and epigenetic editing. Structure-guided protein engineering of Cas12a yields variants that have increased activity and that can edit sites with previously inaccessible PAMs.
0
Citation517
0
Save
0

LincRNA-p21 Regulates Neointima Formation, Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation, Apoptosis, and Atherosclerosis by Enhancing p53 Activity

Gengze Wu et al.Aug 26, 2014
Long noncoding RNAs (lncRNAs) have recently been implicated in many biological processes and diseases. Atherosclerosis is a major risk factor for cardiovascular disease. However, the functional role of lncRNAs in atherosclerosis is largely unknown.We identified lincRNA-p21 as a key regulator of cell proliferation and apoptosis during atherosclerosis. The expression of lincRNA-p21 was dramatically downregulated in atherosclerotic plaques of ApoE(-/-) mice, an animal model for atherosclerosis. Through loss- and gain-of-function approaches, we showed that lincRNA-p21 represses cell proliferation and induces apoptosis in vascular smooth muscle cells and mouse mononuclear macrophage cells in vitro. Moreover, we found that inhibition of lincRNA-p21 results in neointimal hyperplasia in vivo in a carotid artery injury model. Genome-wide analysis revealed that lincRNA-p21 inhibition dysregulated many p53 targets. Furthermore, lincRNA-p21, a transcriptional target of p53, feeds back to enhance p53 transcriptional activity, at least in part, via binding to mouse double minute 2 (MDM2), an E3 ubiquitin-protein ligase. The association of lincRNA-p21 and MDM2 releases MDM2 repression of p53, enabling p53 to interact with p300 and to bind to the promoters/enhancers of its target genes. Finally, we show that lincRNA-p21 expression is decreased in patients with coronary artery disease.Our studies identify lincRNA-p21 as a novel regulator of cell proliferation and apoptosis and suggest that this lncRNA could serve as a therapeutic target to treat atherosclerosis and related cardiovascular disorders.
0
Citation452
0
Save
0

Assessment of computational methods for the analysis of single-cell ATAC-seq data

Huidong Chen et al.Nov 18, 2019
Recent innovations in single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing (scATAC-seq) enable profiling of the epigenetic landscape of thousands of individual cells. scATAC-seq data analysis presents unique methodological challenges. scATAC-seq experiments sample DNA, which, due to low copy numbers (diploid in humans), lead to inherent data sparsity (1-10% of peaks detected per cell) compared to transcriptomic (scRNA-seq) data (10-45% of expressed genes detected per cell). Such challenges in data generation emphasize the need for informative features to assess cell heterogeneity at the chromatin level.We present a benchmarking framework that is applied to 10 computational methods for scATAC-seq on 13 synthetic and real datasets from different assays, profiling cell types from diverse tissues and organisms. Methods for processing and featurizing scATAC-seq data were compared by their ability to discriminate cell types when combined with common unsupervised clustering approaches. We rank evaluated methods and discuss computational challenges associated with scATAC-seq analysis including inherently sparse data, determination of features, peak calling, the effects of sequencing coverage and noise, and clustering performance. Running times and memory requirements are also discussed.This reference summary of scATAC-seq methods offers recommendations for best practices with consideration for both the non-expert user and the methods developer. Despite variation across methods and datasets, SnapATAC, Cusanovich2018, and cisTopic outperform other methods in separating cell populations of different coverages and noise levels in both synthetic and real datasets. Notably, SnapATAC is the only method able to analyze a large dataset (> 80,000 cells).
Load More