Abstract An abnormal neutrophil subset has been identified in the PBMC fractions from lupus patients. We have proposed that these low-density granulocytes (LDGs) play an important role in lupus pathogenesis by damaging endothelial cells and synthesizing increased levels of proinflammatory cytokines and type I IFNs. To directly establish LDGs as a distinct neutrophil subset, their gene array profiles were compared with those of autologous normal-density neutrophils and control neutrophils. LDGs significantly overexpress mRNA of various immunostimulatory bactericidal proteins and alarmins, relative to lupus and control neutrophils. In contrast, gene profiles of lupus normal-density neutrophils do not differ from those of controls. LDGs have heightened capacity to synthesize neutrophils extracellular traps (NETs), which display increased externalization of bactericidal, immunostimulatory proteins, and autoantigens, including LL-37, IL-17, and dsDNA. Through NETosis, LDGs have increased capacity to kill endothelial cells and to stimulate IFN-α synthesis by plasmacytoid dendritic cells. Affected skin and kidneys from lupus patients are infiltrated by netting neutrophils, which expose LL-37 and dsDNA. Tissue NETosis is associated with increased anti-dsDNA in sera. These results expand the potential pathogenic roles of aberrant lupus neutrophils and suggest that dysregulation of NET formation and its subsequent responses may play a prominent deleterious role.

Lupus nephritis is a potentially fatal autoimmune disease for which the current treatment is ineffective and often toxic. To develop mechanistic hypotheses of disease, we analyzed kidney samples from patients with lupus nephritis and from healthy control subjects using single-cell RNA sequencing. Our analysis revealed 21 subsets of leukocytes active in disease, including multiple populations of myeloid cells, T cells, natural killer cells and B cells that demonstrated both pro-inflammatory responses and inflammation-resolving responses. We found evidence of local activation of B cells correlated with an age-associated B-cell signature and evidence of progressive stages of monocyte differentiation within the kidney. A clear interferon response was observed in most cells. Two chemokine receptors, CXCR4 and CX3CR1, were broadly expressed, implying a potentially central role in cell trafficking. Gene expression of immune cells in urine and kidney was highly correlated, which would suggest that urine might serve as a surrogate for kidney biopsies. Much about the kidney-resident immune populations is a black box. Hacohen and colleagues use single cell RNA sequencing of kidney, skin and urine from lupus nephritis patients to describe the transcriptional state of the immune cells present in each compartment.

Renal and urinary EGF can serve as biomarkers for prediction of outcomes in chronic kidney disease.

OBJECTIVE—Glomerular mesangial expansion and podocyte loss are important early features of diabetic nephropathy, whereas tubulointerstitial injury and fibrosis are critical for progression of diabetic nephropathy to kidney failure. Therefore, we analyzed the expression of genes in glomeruli and tubulointerstitium in kidney biopsies from diabetic nephropathy patients to identify pathways that may be activated in humans but not in murine models of diabetic nephropathy that fail to progress to glomerulosclerosis, tubulointerstitial fibrosis, and kidney failure. RESEARCH DESIGN AND METHODS—Kidney biopsies were obtained from 74 patients (control subjects, early and progressive type 2 diabetic nephropathy). Glomerular and tubulointerstitial mRNAs were microarrayed, followed by bioinformatics analyses. Gene expression changes were confirmed by real-time RT-PCR and immunohistological staining. Samples from db/db C57BLKS and streptozotocin-induced DBA/2J mice, commonly studied murine models of diabetic nephropathy, were analyzed. RESULTS—In human glomeruli and tubulointerstitial samples, the Janus kinase (Jak)-signal transducer and activator of transcription (Stat) pathway was highly and significantly regulated. Jak-1, -2, and -3 as well as Stat-1 and -3 were expressed at higher levels in patients with diabetic nephropathy than in control subjects. The estimated glomerular filtration rate significantly correlated with tubulointerstitial Jak-1, -2, and -3 and Stat-1 expression (R2 = 0.30–0.44). Immunohistochemistry found strong Jak-2 staining in glomerular and tubulointerstitial compartments in diabetic nephropathy compared with control subjects. In contrast, there was little or no increase in expression of Jak/Stat genes in the db/db C57BLKS or diabetic DBA/2J mice. CONCLUSIONS—These data suggest a direct relationship between tubulointerstitial Jak/Stat expression and progression of kidney failure in patients with type 2 diabetic nephropathy and distinguish progressive human diabetic nephropathy from nonprogressive murine diabetic nephropathy.

SSc is a devastating disease that results in fibrosis of the skin and other organs. Fibroblasts are a key driver of the fibrotic process through deposition of extracellular matrix. The mechanisms by which fibroblasts are induced to become pro-fibrotic remain unclear. Thus, we examined the ability of SSc keratinocytes to promote fibroblast activation and the source of this effect. Keratinocytes were isolated from skin biopsies of 9 lcSSc, 10 dcSSc and 13 control patients. Conditioned media was saved from the cultures. Normal fresh primary fibroblasts were exposed to healthy control and SSc keratinocyte conditioned media in the presence or absence of neutralizing antibodies for TGF-β. Gene expression was assessed by microarrays and real-time PCR. Immunocytochemistry was performed for α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen type 1 (COL1A1) and CCL5 expression. SSc keratinocyte conditioned media promoted fibroblast activation, characterized by increased α-SMA and COL1A1 mRNA and protein expression. This effect was independent of TGF-β. Microarray analysis identified upregulation of nuclear factor κB (NF-κB) and downregulation of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR-γ) pathways in both SSc subtypes. Scleroderma keratinocytes exhibited increased expression of NF-κB-regulated cytokines and chemokines and lesional skin staining confirmed upregulation of CCL5 in basal keratinocytes. Scleroderma keratinocytes promote the activation of fibroblasts in a TGF-β-independent manner and demonstrate an imbalance in NF-κB1 and PPAR-γ expression leading to increased cytokine and CCL5 production. Further study of keratinocyte mediators of fibrosis, including CCL5, may provide novel targets for skin fibrosis therapy.

Lupus nephritis (LN) is a frequent manifestation of systemic lupus erythematosus, and fewer than half of patients achieve complete renal response with standard immunosuppressants. Identifying non-invasive, blood-based pathologic immune alterations associated with renal injury could aid therapeutic decisions. Here, we used mass cytometry immunophenotyping of peripheral blood mononuclear cells in 145 patients with biopsy-proven LN and 40 healthy controls to evaluate the heterogeneity of immune activation in patients with LN and to identify correlates of renal parameters and treatment response. Unbiased analysis identified 3 immunologically distinct groups of patients with LN that were associated with different patterns of histopathology, renal cell infiltrates, urine proteomic profiles, and treatment response at one year. Patients with enriched circulating granzyme B+ T cells at baseline showed more severe disease and increased numbers of activated CD8 T cells in the kidney, yet they had the highest likelihood of treatment response. A second group characterized primarily by a high type I interferon signature had a lower likelihood of response to therapy, while a third group appeared immunologically inactive by immunophenotyping at enrollment but with chronic renal injuries. Main immune profiles could be distilled down to 5 simple cytometric parameters that recapitulate several of the associations, highlighting the potential for blood immune profiling to translate to clinically useful non-invasive metrics to assess immune-mediated disease in LN.

Photosensitivity is observed in numerous autoimmune diseases and drives poor quality of life and disease flares. Elevated epidermal type I interferon (IFN) production primes for photosensitivity and enhanced inflammation, but the substrates that sustain and amplify this cycle remain undefined. Here, we show that IFN-induced Z-DNA binding protein 1 (ZBP1) stabilizes ultraviolet (UV)B-induced cytosolic Z-DNA derived from oxidized mitochondrial DNA. ZBP1 is significantly upregulated in the epidermis of adult and pediatric patients with autoimmune photosensitivity. Strikingly, lupus keratinocytes accumulate extensive cytosolic Z-DNA after UVB, and transfection of keratinocytes with Z-DNA results in stronger IFN production through cGAS-STING activation compared to B-DNA. ZBP1 knockdown abrogates UV-induced IFN responses, whereas overexpression results in a lupus-like phenotype with spontaneous Z-DNA accumulation and IFN production. Our results highlight Z-DNA and ZBP1 as critical mediators for UVB-induced inflammation and uncover how type I IFNs prime for cutaneous inflammation in photosensitivity.

Abstract The diagnosis of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) requires a renal biopsy, which is invasive and can be problematic in children and in some adults. We used single cell RNA-sequencing to explore disease-related cellular signatures in 23 urine samples from 12 FSGS subjects. We identified immune cells, predominantly monocytes, and renal epithelial cells, including podocytes. Analysis revealed M1 and M2 monocyte subsets, and podocytes showing high expression of genes for epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). We confirmed M1 and M2 gene signatures using published monocyte/macrophage data from lupus nephritis and cancer. Using renal transcriptomic data from the Nephrotic Syndrome Study Network (NEPTUNE), we found that urine cell immune and EMT signature genes showed higher expression in FSGS biopsies compared to minimal change disease biopsies. These results suggest that urine cell profiling may serve as a diagnostic and prognostic tool in nephrotic syndrome and aid in identifying novel biomarkers and developing personalized therapeutic strategies.

 We present a detailed analysis of myeloid cell populations found in the kidneys of lupus nephritis (LN) patients, based on the single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data collected as part of the Accelerating Medicines Partnership (AMP) in RA/SLE consortium. Overall, 23,819 cells isolated from 156 LN patients and 30 healthy donors passed QC. Clustering of these cells (figure 1A) identified populations of CD14 and CD16 monocytes, two subsets of tissue-resident macrophages and several types of dendritic cells (DCs). In addition, we found several transcriptionally-distinct subsets of differentiated macrophages, that were missing from healthy donors (figure 1B- C). The ratio between the frequency of these macrophage subsets and that of infiltrating monocytes positively correlated with the Activity Index (AI) (figure 1D). To infer the origins of the observed disease-specific macrophages, we compared them to several published scRNA-seq datasets of blood and kidney samples, and performed in addition trajectory analysis. Our results suggested that these subsets likely originate from both infiltrating monocytes and tissue-resident macrophages (figure 2A). Furthermore, our analysis indicated that the differentiation into disease-specific macrophages mostly takes place within the kidney. To identify putative extracellular signals driving the differentiation of infiltrating CD16 monocytes into disease-related activation states, we performed in vitro experiments in which CD16 monocytes were stimulated with a wide array of cytokines and molecules suggested to play role in SLE pathology, such as immune complexes (ICs) and various types of cellular debris. We measured transcriptional changes associated with each in vitro condition, and utilized the generated data to identify enriched signatures in the AMP scRNA-seq data, using gene set enrichment analysis (GSEA). This analysis suggested that apoptotic cells likely promote differentiation of CD16 monocytes into a phagocytic state (cluster 11; figure 2B). In contrast, ICs containing TLR7 ligands, as well as IFNγ, were found to be plausible drivers of differentiation into an activation state that was characterized by high production of several proinflammatory cytokines and chemokines ('high producers' – clusters 12 and 13; figure 2C-D). Of note, our analysis suggested that through chemokine production, these 'high producers' may play a central role in recruiting and retaining the phagocytic macrophage subsets. The frequency of a single population of disease-specific macrophages positively correlated with both the AI and the Chronicity Index (CI; figure 3A-B). This population (cluster 17) was characterized by the upregulation of a set of genes associated with lipid metabolism. While previous studies have reported the presence of a similar macrophage subset in other tissues, this has not yet been demonstrated in kidneys. Furthermore, our analysis identified subclusters within this population, associated with different specific pathways, that were separately correlated with the AI and CI. In particular, we found a proinflammatory signature in these cells that was negatively correlated with the AI and positively correlated with the CI (figure 3C-D). A systemic differential expression analysis showed that several myeloid subsets modulated their gene expression in a manner correlated with the AI, compared to healthy donors; a particular clear response was observed in CD16 monocytes (cluster 2), in both proliferative/mixed and pure membranous LN (figure 4A-B). GSEA suggested that these changes were driven, at least in part, by type I and type II IFN, IL-6 and TNFβ. A conjoint analysis of changes in subset frequencies and of the differentially expressed (DE) genes in these populations and in glomerular endothelial cells pointed to the concurrent upregulation of molecules that may promote fibrosis, and in particular fibronectin in CD16 monocytes and integrins capable of binding it in glomerular endothelial cells (figure 4D-F); furthermore, several of the phagocytic macrophages derived from CD16 monocytes upregulated a set of genes regulating the extracellular matrix (figure 4G). Of note, these observations were found in LN patients that had a 0 glomerular CI (defined as the sum of glomerular subscores of the CI), suggesting that these molecular events precede fibrosis and may promote it. An increase in glomerular CI was associated with significant changes in gene expression, in particular in cDC2 and pDCs (clusters 4 & 15), as well as 2 specific populations of phagocytic macrophages (clusters 14 and 15; figure 4C); these changes included a decrease in the interferon response. We verified the reproducibility of these signatures in an independent set of LN patients. Taken together, our results shed light on the mechanisms of kidney inflammation in LN, and provide a detailed view of the different subsets and activation states of myeloid cells found in LN kidneys and the putative relations between them, as well as the extracellular signals giving rise to these states.