Abstract Nucleosomes composed of histones are the fundamental units around which DNA is wrapped to form chromatin. Transcriptionally active euchromatin or repressive heterochromatin is regulated in part by the addition or removal of histone post-translational modifications (PTMs) by ‘writer’ and ‘eraser’ enzymes, respectively. Nucleosomal PTMs are recognised by a variety of ‘reader’ proteins which alter gene expression accordingly. The histone tails of the evolutionarily divergent eukaryotic parasite Trypanosoma brucei have atypical sequences and PTMs distinct from those often considered universally conserved. Here we identify 68 predicted readers, writers and erasers of histone acetylation and methylation encoded in the T. brucei genome and, by epitope tagging, systemically localize 63 of them in the parasite’s bloodstream form. ChIP-seq demonstrated that fifteen candidate proteins associate with regions of RNAPII transcription initiation. Eight other proteins exhibit a distinct distribution with specific peaks at a subset of RNAPII transcription termination regions marked by RNAPIII-transcribed tRNA and snRNA genes. Proteomic analyses identified distinct protein interaction networks comprising known chromatin regulators and novel trypanosome-specific components. Notably, several SET-domain and Bromo-domain protein networks suggest parallels to RNAPII promoter-associated complexes in conventional eukaryotes. Further, we identify likely components of TbSWR1 and TbNuA4 complexes whose enrichment coincides with the SWR1-C exchange substrate H2A.Z at RNAPII transcriptional start regions. The systematic approach employed provides detail of the composition and organization of the chromatin regulatory machinery in Trypanosoma brucei and establishes a route to explore divergence from eukaryotic norms in an evolutionarily ancient but experimentally accessible eukaryote.

Abstract Accurate chromosome segregation requires the attachment of spindle microtubules to centromeres, which are epigenetically defined by the enrichment of CENP-A nucleosomes. During DNA replication, existing CENP-A nucleosomes undergo dilution as they get redistributed among the two DNA strands. To preserve centromere identity, CENP-A levels must be restored in a cell-cycle controlled manner orchestrated by the Mis18 complex. Here we provide a comprehensive mechanistic basis for PLK1-mediated licensing of CENP-A loading. We demonstrate that PLK1 interacts with Mis18α and Mis18BP1 subunits of the Mis18 complex by recognising self-primed phosphorylations of Mis18α (S54) and Mis18BP1 (T78 and S93) through its Polo-box binding domain. Disrupting these PLK1 phosphorylations perturbed the centromere recruitment of HJURP and new CENP-A loading. Biochemical and functional analyses show that phosphorylation of Mis18α and subsequent PLK1 binding is required to activate the Mis18α/β complex for robust Mis18α/β-HJURP interaction. Thus, our study reveals key molecular events underpinning the licensing role of PLK1 in ensuring accurate centromere inheritance. One-Sentence Summary PLK1 phosphorylation cascade licenses CENP-A loading by facilitating HJURP centromere recruitment via Mis18α/β activation.

Abstract The Chromosomal Passenger Complex (CPC; consisting of Borealin, Survivin, INCENP and Aurora B kinase) and Shugoshin 1 (Sgo1) are key regulators of chromosome bi-orientation, a process essential for error-free chromosome segregation. Their functions rely on their ability to associate with centromeres. Two histone phosphorylations, histone H3 Thr3 (H3T3ph; directly recognised by Survivin) and histone H2A Thr120 (H2AT120ph; indirectly recognised via Sgo1), together with CPC’s intrinsic ability to bind nucleosome, facilitate CPC centromere recruitment. The molecular basis for CPC-Sgo1 binding and how their direct interaction influences CPC centromere localisation and function are lacking. Here, using an integrative structure-function approach, we show that the histone H3-like Sgo1 N-terminal tail interacts with Survivin acting as a hot-spot for CPC-Sgo1 assembly, while downstream Sgo1 residues, mainly with Borealin contributes for high affinity interaction. Disruption of the Sgo1 N-terminal tail-Survivin interaction abolished CPC-Sgo1 assembly in vitro and perturbed centromere localisation and function of CPC. Our findings provide evidence that CPC binding to Sgo1 and histone H3 N-terminal tail are mutually exclusive, suggesting that these interactions will likely take place in a spatially/temporally restricted manner and provide a rationale for the Sgo1-mediated ‘kinetochore proximal centromere’ pool of CPC.

Abstract The PP2A-B55 phosphatase regulates a plethora of signaling pathways throughout eukaryotes. How PP2A-B55 selects its substrates presents a severe knowledge gap. By integrating AlphaFold modelling with comprehensive high resolution mutational scanning, we show that α-helices in substrates bind B55 through an evolutionary conserved mechanism. Despite a large diversity in sequence and composition, these α-helices share key amino acid determinants that engage discrete hydrophobic and electrostatic patches. Using deep learning protein design, we generate a specific and potent competitive peptide inhibitor of PP2A-B55 substrate interactions. With this inhibitor, we uncover that PP2A-B55 regulates the nuclear exosome targeting complex by binding to an α-helical recruitment module in RBM7. Collectively, our findings provide a framework for the understanding and interrogation of PP2A-B55 in health and disease. One sentence summary α-helices in PP2A-B55 substrates bind a conserved pocket on B55 through a common mechanism that is conserved in eukaryotes.

Abstract Paralogous variants of canonical histones guide accessibility to DNA and function as additional layers of genome regulation. Across eukaryotes, the occurrence, mechanism of action and functional significance of several variants of core histones are well known except that of histone H4. Here we show that a novel variant of H4 (H4.V), expressing tissue-specifically among members of Oryza genera, mediates specific epigenetic changes contributing majorly to salt tolerance. H4.V was incorporated to specific chromosomal locations where it blocked deposition of active histone marks. Under salt stress, large scale re-distribution of H4.V enabled incorporation of stress dependent histone H4 Lysine5 Acetylation (H4K5Ac) marks. Mis-expression of H4.V led to defects at morphological level especially in reproductive tissues, and in mounting stress responses. H4.V mediated these alterations by condensing chromatin at specific genomic regions as seen with cryo-EM structure of reconstituted H4.V containing nucleosomes. These results not only uncovered the presence of a H4 variant in plants, but also a novel chromatin regulation of stress responses that might have contributed to success of semi-aquatic Oryza members under variable water-limiting conditions. One-line summary Histone H4 variant predisposes chromatin for stress responses Abstract Figure

During mitosis, interphase chromatin is rapidly converted into rod-shaped mitotic chromosomes. Using Hi-C, imaging, proteomics and polymer modeling, we determine how the activity and interplay between loop-extruding SMC motors accomplishes this dramatic transition. Our work reveals rules of engagement for SMC complexes that are critical for allowing cells to refold interphase chromatin into mitotic chromosomes. We find that condensin disassembles interphase chromatin loop organization by evicting or displacing extrusive cohesin. In contrast, condensin bypasses cohesive cohesins, thereby maintaining sister chromatid cohesion while separating the sisters. Studies of mitotic chromosomes formed by cohesin, condensin II and condensin I alone or in combination allow us to develop new models of mitotic chromosome conformation. In these models, loops are consecutive and not overlapping, implying that condensins do not freely pass one another but stall upon encountering each other. The dynamics of Hi-C interactions and chromosome morphology reveal that during prophase loops are extruded in vivo at ~1-3 kb/sec by condensins as they form a disordered discontinuous helical scaffold within individual chromatids.

Abstract Cryptococcus neoformans is an opportunistic, human fungal pathogen which undergoes fascinating switches in cell cycle control and ploidy when it encounters stressful environments such as the human lung. Here we carry out a mechanistic analysis of the spindle assembly checkpoint (SAC) which regulates the metaphase to anaphase transition, focusing on Mps1 kinase and the downstream checkpoint components Mad1 and Mad2. We demonstrate that Cryptococcus mad1Δ or mad2Δ strains are unable to respond to microtubule perturbations, continuing to re-bud and divide, and die rapidly as a consequence. Fluorescent tagging of Chromosome 3, using a lacO array and mNeonGreen-lacI fusion protein, demonstrates that mad mutants are unable to maintain sister-chromatid cohesion in the absence of microtubule polymers. Thus, the classic checkpoint functions of the SAC are conserved in Cryptococcus . In interphase, GFP-Mad1 is enriched at the nuclear periphery, and it is recruited to unattached kinetochores in mitosis. Purification of GFP-Mad1 followed by mass spectrometric analysis of associated proteins show that that it forms a complex with Mad2 and that it interacts with other checkpoint signalling components (Bub1) and effectors (Cdc20 and APC/C sub-units) in mitosis. We also demonstrate that overexpression of Mps1 kinase is sufficient to arrest Cryptococcus cells in mitosis, and show that this arrest is dependent on both Mad1 and Mad2. We find that a C-terminal fragment of Mad1 is an effective in vitro substrate for Mps1 kinase and map several Mad1 phosphorylation sites. Some sites are highly conserved within the C-terminal Mad1 structure and we demonstrate that mutation of threonine 667 (T667A) leads to loss of checkpoint signalling and abrogation of the GAL-MPS1 arrest. Thus Mps1-dependent phosphorylation of C-terminal Mad1 residues is a critical step in Cryptococcus spindle checkpoint signalling. Finally, we analyse the phenotype of mad and mps1 mutants during titan cell generation: quantitating viability of titan cells and their daughters generated during the ensuing reductive division. The mad1Δ, mad2Δ and mpsΔ mutants show significantly reduced viability: many titans are dead and others produce slow growing colonies. We propose that these Cryptococcus neoformans checkpoint proteins have important roles in ensuring high fidelity chromosome segregation during stressful conditions, such that those heightened during its polyploid infection cycle.

Summary CENP-A chromatin specifies mammalian centromere identity, and its chaperone HJURP replenishes CENP-A when recruited by the Mis18 complex (Mis18C) via M18BP/KNL2 to CENP-C at kinetochores during interphase. However, the Mis18C recruitment mechanism remains unresolved in species lacking M18BP1, such as fission yeast. Fission yeast centromeres cluster at G2 spindle pole bodies (SPBs) when CENP-A Cnp1 is replenished and where Mis18C also localizes. We show that SPBs play an unexpected role in concentrating Mis18C near centromeres through the recruitment of Mis18 by direct binding to the major SPB LI nker of N ucleoskeleton and C ytoskeleton (LINC) complex component Sad1. Mis18 recruitment by Sad1 is important for CENP-A Cnp1 chromatin establishment and acts in parallel with a CENP-C-mediated Mis18C recruitment pathway to maintain centromeric CENP-A Cnp1 , but is independent of Sad1-mediated centromere clustering. SPBs therefore provide a non-chromosomal scaffold for both Mis18C recruitment and centromere clustering during G2. This centromere-independent Mis18-SPB recruitment provides a mechanism that governs de novo CENP-A Cnp1 chromatin assembly by the proximity of appropriate sequences to SPBs and highlights how nuclear spatial organization influences centromere identity.

ABSTRACT Increased nuclear size correlates with lower survival rates for prostate cancer and is a hallmark of late-stage androgen-insensitive tumors. The short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) family member DHRS7 was suggested as a marker for prostate cancer grading because it is lost in late-stage androgen-insensitive tumors. Here we find that loss of DHRS7 from the early-stage LNCaP prostate cancer cell line increases nuclear size, potentially explaining the nuclear size increase observed in higher-grade prostate tumors. Exogenous expression of DHRS7 in the late-stage PC3 prostate cancer cell line correspondingly decreases nuclear size. We separately tested 80 compounds from the Microsource Spectrum library for their ability to restore normal nuclear size to PC3 cells, finding estradiol propionate had the same effect as re-expression of DHRS7 in the PC3 cells. However, the drug had no effect on LNCaP cells or PC3 cells re-expressing DHRS7. We speculate that reported beneficial effects of estrogens in late-stage prostate cancer may target a pathway which is only active in cells lacking DHRS7 that have increased nuclear size and propose DHRS7 as a potential biomarker for the likely effectiveness of estrogen-based treatments.

Recent studies have challenged the prevailing dogma that transcription is repressed during mitosis. Transcription was also proposed to sustain the spindle assembly checkpoint (SAC) for several hours in response to unattached kinetochores. Here we used live-cell imaging of human cells in culture, combined with RNA-seq and qPCR, to investigate the requirement for de novo transcription during mitosis. Under conditions of persistently unattached kinetochores, transcription inhibition with actinomycin D, or treatment with other DNA-intercalating drugs, delocalized the chromosomal passenger complex (CPC) protein Aurora B from centromeres, compromising SAC robustness and cell fate. However, we were unable to detect significant changes in transcript levels. Moreover, inhibition of transcription independently of DNA intercalation had no effect on SAC response, mitotic progression, exit or death. Mechanistically, we show that DNA intercalating agents reduce the interaction of the CPC with nucleosomes. Thus, the capacity of human cells to progress, sustain, exit or die in mitosis relies on centromere integrity, rather than de novo transcription.