Forking Replisomes Replisomes are multiprotein machines that replicate DNA. Significant insight into how they work comes from in vitro studies, but how replisomes are organized in living cells has remained unclear. Reyes-Lamothe et al. (p. 498 ) have watched the replisome in living Escherichia coli cells using single-molecule fluorescence spectroscopy with millisecond time resolution. Cells expressing fluorescent derivatives of 10 different replisome components revealed both the stoichiometry and spatial distribution of the components at active replication forks in Escherichia coli . A similar technique could be used to study other molecular machines as they function.

Abstract Liquid-liquid phase separation is emerging as a crucial phenomenon in several fundamental cell processes. A range of eukaryotic systems exhibit liquid condensates. However, their function in bacteria, which in general lack membrane-bound compartments, remains less clear. Here, we used high-resolution optical microscopy to observe single bacterial aggresomes, nanostructured intracellular assemblies of proteins, to undercover their role in cell stress. We find that proteins inside aggresomes are mobile and undergo dynamic turnover, consistent with a liquid state. Our observations are in quantitative agreement with phase-separated liquid droplet formation driven by interacting proteins under thermal equilibrium that nucleate following diffusive collisions in the cytoplasm. We have discovered aggresomes in multiple species of bacteria, and show that these emergent, metastable liquid-structured protein assemblies increase bacterial fitness by enabling cells to tolerate environmental stresses. One Sentence Summary Bacteria use subcellular proteinaceous liquid droplets to survive stress

1. Abstract Cells employ myriad regulatory mechanisms to maintain protein homeostasis, termed proteostasis, to ensure correct cellular function. Dysregulation of proteostasis, which is often induced by physiological stress and ageing, often results in protein aggregation in cells. These aggregated structures can perturb normal physiological function, compromising cell integrity and viability, a prime example being early onset of several neurodegenerative diseases. Understanding aggregate dynamics in vivo is therefore of strong interest for biomedicine and pharmacology. However, factors involved in formation, distribution and clearance of intracellular aggregates are not fully understood. Here, we report an improved methodology for production of fluorescent aggregates in model budding yeast which can be detected, tracked and quantified using fluorescence microscopy in live cells. This new openly-available technology, iPAR (inducible Protein Aggregation Reporter), involves monomeric fluorescent protein reporters fused to a ΔssCPY* aggregation biomarker, with expression controlled under the copper-regulated CUP1 promoter. Monomeric tags overcome challenges associated with non-physiological reporter aggregation, whilst CUP1 provides more precise control of protein production. We show that iPAR and the associated bioimaging methodology enables quantitative study of cytoplasmic aggregate kinetics and inheritance features in vivo . We demonstrate that iPAR can be used with traditional epifluorescence and confocal microscopy as well as single-molecule precise Slimfield millisecond microscopy. Our results indicate that cytoplasmic aggregates are mobile and contain a broad range of number of iPAR molecules, from tens to several hundred per aggregate, whose mean value increases with extracellular hyperosmotic stress. Time lapse imaging shows that although larger iPAR aggregates associate with nuclear and vacuolar compartments, and for the first time we show directly that these proteotoxic accumulations are not inherited by daughter cells, unlike nuclei and vacuoles. If suitably adapted, iPAR offers new potential for studying diseases relating to protein oligomerization processes in other model cellular systems.

Abstract Most cells adapt to their environment by switching combinations of genes on and off through a complex interplay of transcription factor proteins (TFs). The mechanisms by which TFs respond to signals, move into the nucleus and find specific binding sites in target genes is still largely unknown. Single-molecule fluorescence microscopes, which can image single TFs in live cells, have begun to elucidate the problem. Here, we show that different environmental signals, in this case carbon sources, yield a unique single-molecule fluorescence pattern of foci of a key metabolic regulating transcription factor, Mig1, in the nucleus of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae . This pattern serves as a ‘barcode’ of the gene regulatory state of the cells which can be correlated with cell growth characteristics and other biological function. Highlights Single-molecule microscopy of transcription factors in live yeast Barcoding single-molecule nuclear fluorescence Correlation with cell growth characteristics Growth in different carbon sources

Abstract As camera pixel arrays have grown larger and faster, and optical microscopy techniques ever more refined, there has been an explosion in the quantity of data acquired during routine light microcopy. At the single-molecule level, analysis involves multiple steps and can rapidly become computationally expensive, in some cases intractable on office workstations. Complex bespoke software can present high activation barriers to entry for new users. Here, we redevelop our quantitative single-molecule analysis routines into an optimized and extensible Python program, with GUI and command-line implementations to facilitate use on local machines and remote clusters, by beginners and advanced users alike. We demonstrate that its performance is on par with previous MATLAB implementations but runs an order of magnitude faster. We tested it against challenge data and demonstrate its performance is comparable to state-of-the-art analysis platforms. We show the code can extract fluorescence intensity values for single reporter dye molecules and, using these, estimate molecular stoichiometries and cellular copy numbers of fluorescently-labeled biomolecules. It can evaluate 2D diffusion coefficients for the characteristically short single-particle tracking data. To facilitate benchmarking we include data simulation routines to compare different analysis programs. Finally, we show that it works with 2-color data and enables colocalization analysis based on overlap integration, to infer interactions between differently labelled biomolecules. By making this freely available we aim to make complex light microscopy single-molecule analysis more democratized. Highlights We present PySTACHIO, a refined version of our spot tracking algorithm We demonstrate highly improved performance over previous MATLAB versions PySTACHIO can accurately estimate stoichiometries and 2D diffusion coefficients Performance is comparable to state-of-the-art packages on challenge data PySTACHIO has both GUI and command line interfaces and can be hosted as a web app Graphical abstract

Abstract Epigenetic regulation maintains gene expression patterns over many rounds of cell division in higher organisms. However, visualization of factors regulating epigenetic switches in vivo is limited by the challenge of imaging cells deep in living tissue, with molecular sensitivity and rapid sampling. We report an easy-to-implement method called Variable-angle Slimfield microscopy (SlimVar), which by simple modification of an inverted optical microscope, enables single-molecule tracking of fluorescent reporters in Arabidopsis thaliana . Using SlimVar, we imaged stepwise photobleaching of chromatin-protein assemblies in individual nuclei, 30 µm deep in root tips through multiple cell layers. We find that two homologous proteins key to the epigenetic switch at FLOWERING LOCUS C ( FLC ) —cold-induced VERNALIZATION INSENSITIVE3 (VIN3) and constitutively expressed VERNALIZATION 5 (VRN5)—exhibit dynamic nuclear assemblies during FLC silencing. Upon cold exposure, these assemblies increase in stoichiometry by up to 100% to a median of ∼20 molecules. Larger VRN5 assemblies preferentially co-localize with an FLC lacO transgenic reporter during prolonged cold, persisting after return to warm conditions. Our findings support a hybrid model of epigenetic memory in which nucleation of histone trimethylation is assisted by dynamic protein assemblies over extended durations. SlimVar therefore has potential to offer molecular insights into proteins expressed at physiological levels in a range of tissues.

Abstract The RecA protein and RecBCD complex are key bacterial components for the maintenance and repair of DNA. RecBCD is a helicase-nuclease that uses homologous recombination to resolve double-stranded DNA breaks. It also facilitates coating of single-stranded DNA with RecA to form RecA filaments, a vital step in the double-stranded break DNA repair pathway. However, questions remain about the mechanistic roles of RecA and RecBCD in live cells. Here, we use millisecond super-resolved fluorescence microscopy to pinpoint the spatial localization of fluorescent reporters of RecA or RecB at physiological levels of expression in individual live Escherichia coli cells. By introducing the DNA crosslinker mitomycin C, we induce DNA damage and quantify the resulting steady state changes in stoichiometry, cellular protein copy number and molecular mobilities of RecA and RecB. We find that both proteins accumulate in molecular hotspots to effect repair, resulting in RecA stoichiometries equivalent to several hundred molecules that assemble largely in dimeric subunits before DNA damage, but form periodic subunits of approximately 3-4 molecules within mature filaments of several thousand molecules. Unexpectedly, we find that the physiologically predominant forms of RecB are not only rapidly diffusing monomers, but slowly diffusing dimers.

Abstract CO 2 fixation is commonly limited by inefficiency of the CO 2 -fixing enzyme Rubisco. Eukaryotic algae concentrate and fix CO 2 in phase-separated condensates called pyrenoids, which complete up to one-third of global CO 2 fixation. Condensation of Rubisco in pyrenoids is dependent on interaction with disordered linker proteins that show little conservation between species. We developed a sequence-independent bioinformatic pipeline to identify linker proteins in green algae. We report the linker from Chlorella and demonstrate that it binds a conserved site on the Rubisco large subunit. We show the Chlorella linker phase separates Chlamydomonas Rubisco and that despite their separation by ∼800 million years of evolution, the Chlorella linker can support the formation of a functional pyrenoid in Chlamydomonas . This cross-species reactivity extends to plants, with the Chlorella linker able to drive condensation of some native plant Rubiscos in vitro and in planta . Our results represent an exciting frontier for pyrenoid engineering in plants, which is modelled to increase crop yields.

Summary The ability of tumors to establish a pro-tumorigenic microenvironment is becoming an important point of investigation in the search for new therapeutics. Tumors form microenvironments in part by the ‘education’ of immune cells attracted via chemotactic axes such as that of CCR5-CCL5. Further, CCR5 upregulation by cancer cells, coupled with its association with pro-tumorigenic features such as drug-resistance and metastasis, has suggested CCR5 as a target for therapeutic inhibition. However, with several conformational “pools” being reported, phenotypic investigations must be capable of unveiling heterogeneity. Addressing this challenge, we performed structured illumination (SIM) and Partially TIRF coupled HILO (PaTCH) microscopy for super-resolution imaging and single-molecule imaging of CCR5 in fixed cells. Determining the positions of super-resolved CCR5 assemblies revealed a non-random spatial orientation. Further, intensity-tracking of assemblies revealed a distribution of molecular stoichiometries indicative of dimeric sub-units independent of CCL5 perturbation. These biophysical methods can provide important insights into the structure and function of onco-immunogenic receptors and a plethora of other biomolecules. Highlights We use SIM and novel PaTCH microscopy for precise bioimaging and single-molecule tracking of receptor protein CCR5 in model cell line By tracking the position of CCR5 assemblies we conclude that they are clustered in the plasma membrane beyond a level expected from a random distribution We use these high-precision data to determine molecular stoichiometries of CCR5 assemblies