The implementation of autotrophic anaerobic ammonium oxidation processes for the removal of nitrogen from municipal wastewater (known as “mainstream anammox”) bears the potential to bring wastewater treatment plants close to energy autarky. The aim of the present work was to assess the long-term stability of partial nitritation/anammox (PN/A) processes operating at low temperatures and their reliability in meeting nitrogen concentrations in the range of typical discharge limits below 2 mgNH4-N·L−1 and 10 mgNtot·L−1. Two main 12-L sequencing batch reactors were operated in parallel for PN/A on aerobically pre-treated municipal wastewater (21 ± 5 mgNH4-N·L−1 and residual 69 ± 19 mgCODtot·L−1) for more than one year, including over 5 months at 15 °C. The two systems consisted of a moving bed biofilm reactor (MBBR) and a hybrid MBBR (H-MBBR) with flocculent biomass. Operation at limiting oxygen concentrations (0.15–0.18 mgO2·L−1) allowed stable suppression of the activity of nitrite-oxidizing bacteria at 15 °C with a production of nitrate over ammonium consumed as low as 16% in the MBBR. Promising nitrogen removal rates of 20–40 mgN·L−1·d−1 were maintained at hydraulic retention times of 14 h. Stable ammonium and total nitrogen removal efficiencies over 90% and 70% respectively were achieved. Both reactors reached average concentrations of total nitrogen below 10 mgN·L−1 in their effluents, even down to 6 mgN·L−1 for the MBBR, with an ammonium concentration of 2 mgN·L−1 (set as operational threshold to stop aeration). Furthermore, the two PN/A systems performed almost identically with respect to the biological removal of organic micropollutants and, importantly, to a similar extent as conventional treatments. A sudden temperature drop to 11 °C resulted in significant suppression of anammox activity, although this was rapidly recovered after the temperature was increased back to 15 °C. Analyses of 16S rRNA gene-targeted amplicon sequencing revealed that the anammox guild of the bacterial communities of the two systems was composed of the genus “Candidatus Brocadia”. The potential of PN/A systems to compete with conventional treatments for biological nutrients removal both in terms of removal rates and overall effluent quality was proven.

Abstract Anammox bacteria enable an efficient removal of nitrogen from sewage in processes involving partial nitritation and anammox (PN/A) or nitrification, partial denitrification, and anammox (N-PdN/A). In mild climates, anammox bacteria must be adapted to ≤15 °C, typically by gradual temperature decrease; however, this takes months or years. To reduce the time necessary for the adaptation, an unconventional method of ‘cold shocks’ is promising, involving hours-long exposure of anammox biomass to extremely low temperatures. We compared the efficacies of gradual temperature decrease and cold shocks to increase the metabolic activity of anammox (fed batch reactor, planktonic “ Ca . Kuenenia”). We assessed the cold shock mechanism on the level of protein expression (quantitative shot-gun proteomics, LC-HRMS/MS) and structure of membrane lipids (UPLC-HRMS/MS). The shocked culture was more active (0.66±0.06 vs 0.48±0.06 kg-N/kg-VSS/d) and maintained the relative content of N-respiration proteins at levels consistent levels with the initial state, whereas the content of these proteins decreased in gradually acclimated culture. Cold shocks also induced a more efficient up-regulation of cold shock proteins (e.g. CspB, TypA, ppiD). Ladderane lipids characteristic for anammox evolved to a similar end-point in both cultures which confirms their role in anammox bacteria adaptation to cold and indicates a three-pronged adaptation mechanism involving ladderane lipids (ladderane alkyl length, introduction of shorter non-ladderane alkyls, polar headgroup). Overall, we show the outstanding potential of cold shocks for low-temperature adaptation of anammox bacteria and provide yet unreported detailed mechanisms of anammox adaptation to low temperatures. Highlights Anammox bacteria were adapted to low T by gradual acclimation and cold shocks The shocked culture was more active (0.66±0.06 vs 0.48±0.06 kg-N/kg-VSS/d) N-respiration proteins content decreased in gradually acclimated bacteria Several cold shock proteins were upregulated more efficiently by cold shocks At ↓T, anammox adjusted ladderane membrane lipid composition in three aspects Graphical abstract

The enormous chemical diversity and strain variability of prokaryotic protein glycosylation makes a large-scale exploration exceptionally challenging. Therefore, despite the universal relevance of protein glycosylation across all domains of life, the understanding of their biological significance and the evolutionary forces shaping oligosaccharide structures remains highly limited. Here, we report on a newly established mass binning glycoproteomics approach that establishes the chemical identity of the carbohydrate components and performs untargeted exploration of prokaryotic oligosaccharides from large-scale proteomics data directly. We demonstrate our approach by exploring an enrichment culture of the globally relevant anaerobic ammonium-oxidizing bacterium Ca. Kuenenia stuttgartiensis. By doing so we resolved a remarkable array of oligosaccharides, produced by two entirely unrelated glycosylation machineries targeting the same surface-layer protein (SLP) simultaneously. More intriguingly, the investigated strain also accomplished modulation of highly specialized sugars, supposedly in response to its energy metabolism—the anaerobic oxidation of ammonium —which depends on the acquisition of substrates of opposite charge. Ultimately, we provide a systematic approach for the compositional exploration of prokaryotic protein glycosylation, and reveal for the first time a remarkable balance between maximising cellular protection through a complex array of oligosaccharides and adhering to the requirements of the ‘metabolic lifestyle’.

Rapid sand filters are established and widely applied technologies for groundwater treatment. In these filters, main groundwater contaminants such as iron, manganese, and ammonium are oxidized and removed. Conventionally, intensive aeration is employed to provide oxygen for these redox reactions. While effective, intensive aeration promotes flocculent iron removal, which results in iron oxide flocs that rapidly clog the filter. In this study, we operated two parallel full-scale sand filters at different aeration intensities to resolve the relative contribution of homogeneous, heterogeneous and biological iron removal pathways, and identify their operational controls. Our results show that mild aeration in the LOW filter (5 mg/L O

Abstract The potent greenhouse gas nitrous oxide (N 2 O) originates primarily from natural and engineered microbiomes. Emission seasonality is widely reported while the underlying metabolic controls remain largely unresolved, hindering effective mitigation. We use biological wastewater treatment as tractable model ecosystem over nearly two years. Long-term metagenomic-resolved metaproteomics is combined with ex situ kinetic and full-scale operational characterization. By leveraging the evidence independently obtained at multiple ecophysiological levels, from individual genetic potential to actual metabolism and emergent community phenotype, the cascade of environmental and operational triggers driving N 2 O emissions is resolved. We explain the dynamics in nitrite accumulation with the kinetic unbalance between ammonia and nitrite oxidisers, and identify nitrifier denitrification as the prime N 2 O-producing pathway. The dissolved O 2 emerged as the key actionable parameter for emission control. This work exemplifies the yet-to-be-realized potential of multi-meta-omics approaches for the mechanistic understanding and ecological engineering of microbiomes, ultimately advancing sustainable biotechnological developments.

Abstract Rapid sand filters (RSF) are an established and widely applied technology for groundwater treatment. Yet, the underlying interwoven biological and physical-chemical reactions controlling the sequential removal of iron, ammonia and manganese remain poorly understood. To resolve the contribution and interactions between the individual reactions, we studied two full-scale drinking water treatment plant configurations, namely ( i ) one dual-media (anthracite and quartz sand) filter and ( ii ) two single-media (quartz sand) filters in series. In situ and ex situ activity tests were combined with mineral coating characterization and metagenome-guided metaproteomics along the depth of each filter. Both plants exhibited comparable performances and process compartmentalization, with most of ammonium and manganese removal occurring only after complete iron depletion. Within each compartment, the homogeneity of the media coating and genome-based microbial composition highlighted the effect of backwashing on filter media mixing. In stark contrast, intra-compartment contaminant removal was highly stratified following decreasing substrate availability along the filter height. This apparent and long-standing conflict was resolved by quantifying the expressed proteome at different filter heights, revealing a consistent stratification of proteins catalysing ammonia oxidation and protein-based relative abundances of nitrifying genera. This implies that microorganisms adapt their protein pool to the available nutrient load at a faster rate than the backwash mixing frequency. Ultimately, these results show the unique and complementary potential of metaproteomics to understand metabolic adaptations and interactions in highly dynamic ecosystems.

Abstract Rapid sand filters are established and widely applied technologies for groundwater treatment. Conventionally, intensive aeration is employed to provide oxygen for the oxidation and removal of the main groundwater contaminants. While effective, intensive aeration promotes flocculent iron removal, which results in iron flocs that rapidly clog the filter. In this study, we operated two parallel full-scale sand filters at different aeration intensities to resolve the relative contribution of homogeneous, heterogeneous and biological iron removal pathways, and identify their operational controls. Our results show that mild aeration in the LOW filter (5 mg/L O 2 pH 6.9) promoted biological iron removal and enabled iron oxidation at twice the rate compared to the intensively aerated HIGH filter (>10mg/L O 2, pH 7.4). ESEM images showed distinctive twisted stalk-like Fe solids, biosignatures of Gallionella ferruginea , both in the LOW filter sand coatings as well as in its backwash solids. In accordance, 10 times higher DNA copy numbers of G. ferruginea were found in the LOW filter effluent. Clogging by biogenic FeOx was slower than by chemical FeOx flocs, resulting in lower backwash frequencies and yielding four times more water per run. Ultimately, our results reveal that biological Fe 2+ oxidation can be actively controlled and favoured over competing physico-chemical routes. The resulting operational benefits are only starting to be appreciated, with the counterintuitive higher oxidation rates and water yields at lower aeration regimes, and the production of more compact and practically valuable FeOx solids being of outmost interest.

ABSTRACT Drinking water treatment plants (DWTPs) are designed to remove physical, chemical, and biological contaminants. However, until recently, the role of DWTPs in minimizing the cycling of antibiotic resistance determinants has got limited attention. In particular, the risk of selecting antibiotic-resistant bacteria (ARB) is largely overlooked in chlorine-free DWTPs where biological processes are applied. Here, we combined high-throughput quantitative PCR and metagenomics to analyze the abundance and dynamics of microbial communities, antibiotic resistance genes (ARGs), and mobile genetic elements (MGEs) across the treatment trains of two chlorine-free DWTPs involving dune-based and reservoir-based systems. The microbial diversity of the water being treated increased after all biological unit operations, namely rapid and slow sand filtration (SSF), and granular activated carbon filtration. Both DWTPs reduced the concentration of ARGs and MGEs in the water by about 2.5 log gene copies mL -1 , despite their relative increase in the disinfection sub-units (SSF in dune-based and UV treatment in reservoir-based DWTPs). The total microbial concentration was also reduced (2.5 log units), and none of the DWTPs were enriched for antibiotic resistant bacteria. Our findings highlight the effectiveness of chlorine-free DWTPs in supplying safe drinking water while reducing the concentration of antibiotic resistance determinants. To the best of our knowledge, this is the first study that monitors the presence and dynamics of antibiotic resistance determinants in chlorine-free DWTPs.

Abstract Nitrous oxide (N2O) is a potent greenhouse gas of primarily microbial origin. Oxic and anoxic emissions are commonly ascribed to autotrophic nitrification and heterotrophic denitrification, respectively. Beyond this established dichotomy, we quantitatively show that heterotrophic denitrification can significantly contribute to aerobic nitrogen turnover and N2O emissions in complex microbiomes exposed to frequent oxic/anoxic transitions. Two planktonic, nitrification-inhibited enrichment cultures were established under continuous organic carbon and nitrate feeding, and cyclic oxygen availability. Over a third of the influent organic substrate was respired with nitrate as electron acceptor at high oxygen concentrations (> 6.5 mg/L). N2O accounted for up to one quarter of the nitrate reduced under oxic conditions. The enriched microorganisms maintained a constitutive abundance of denitrifying enzymes due to the oxic/anoxic frequencies exceeding their protein turnover - a common scenario in natural and engineered ecosystems. The aerobic denitrification rates are ascribed primarily to the residual activity of anaerobically synthesized enzymes. From an ecological perspective, the selection of organisms capable of sustaining significant denitrifying activity during aeration shows their competitive advantage over other heterotrophs under varying oxygen availabilities. Ultimately, we propose that the contribution of heterotrophic denitrification to aerobic nitrogen turnover and N2O emissions is currently underestimated in dynamic environments.

Rapid sand filters (RSF) are an established and widely applied technology for the removal of dissolved iron (Fe2+) and ammonium (NH4+) among other contaminants in groundwater treatment. Most often, biological NH4+oxidation is spatially delayed and starts only upon complete Fe2+ depletion. However, the mechanism(s) responsible for the inhibition of NH4+oxidation by Fe2+ or its oxidation (by)products remains elusive, hindering further process control and optimization. We used batch assays, lab-scale columns, and full-scale filter characterizations to resolve the individual impact of the main Fe2+ oxidizing mechanisms and the resulting products on biological NH4+ oxidation. modeling of the obtained datasets allowed to quantitatively assess the hydraulic implications of Fe2+ oxidation. Dissolved Fe2+ and the reactive oxygen species formed as byproducts during Fe2+ oxidation had no direct effect on ammonia oxidation. The Fe3+ oxides on the sand grain coating, commonly assumed to be the main cause for inhibited ammonia oxidation, seemed instead to enhance it. modeling allowed to exclude mass transfer limitations induced by accumulation of iron flocs and consequent filter clogging as the cause for delayed ammonia oxidation. We unequivocally identify the inhibition of NH4+oxidizing organisms by the Fe3+ flocs generated during Fe2+ oxidation as the main cause for the commonly observed spatial delay in ammonia oxidation. The addition of Fe3+ flocs inhibited NH4+oxidation both in batch and column tests, and the removal of Fe3+ flocs by backwashing completely re-established the NH4+removal capacity, suggesting that the inhibition is reversible. In conclusion, our findings not only identify the iron form that causes the inhibition, albeit the biological mechanism remains to be identified, but also highlight the ecological importance of iron cycling in nitrifying environments.