ABSTRACT Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains one of the most challenging cancer to treat. Due to the asymptomatic nature of the disease and ineffective drug treatment modalities, the survival rate of PDAC patients remains one of the lowest. The recurrent genetic alterations in PDAC are yet to be targeted; therefore, identifying effective therapeutic combinations is desperately needed. Here, we performed an in vivo CRISPR screening in a clinically relevant patient-derived xenograft (PDX) model system to identify synergistic drug combinations for PDAC treatment. Our approach revealed protein arginine methyltransferase gene 5 (PRMT5) as a promising druggable candidate whose inhibition creates synergistic vulnerability of PDAC cells to gemcitabine. Genetic and pharmacological inhibition results indicate that of PRMT5 depletion results in synergistic cytotoxicity with Gem due to depleted replication protein A (RPA) levels and an impaired non-homology end joining (NHEJ) DNA repair. Thus, the novel combination creates conditional lethality through the accumulation of excessive DNA damage and cell death, both in vitro and in vivo . The findings demonstrate that unbiased genetic screenings combined with a clinically relevant model system is an effective approach in identifying synthetic lethal drug combinations for cancer treatment. STATEMENT of SIGNIFICANCE Identify synergistic drug combinations for PDAC is a significant unmet need. Through CRISPR screening, we discovered and validated that PRMT5 depletion creates synergistic vulnerability of PDAC cells to gemcitabine. Mechanistically, the combination impairs DNA repair, synergistic accumulation of DNA damage and cell death in vitro and in vivo .

Abstract Regular physical exercise has long been recognized to reverse the effects of diet-induced obesity, but the molecular mechanisms mediating these multi-tissue beneficial effects remain uncharacterized. Here, we address this challenge by studying the opposing effects of exercise training and high-fat diet at single-cell, deconvolution and tissue-level resolutions across 3 metabolic tissues. We profile scRNA-seq in 204,883 cells, grouped into 53 distinct cell subtypes/states in 22 major cell types, from subcuta-neous and visceral white adipose tissue (WAT), and skeletal muscle (SkM) in mice with diet and exercise training interventions. With a great number of mesenchymal stem cells (MSCs) profiled, we compared depot-specific adipose stem cell (ASC) states, and defined 7 distinct fibro-adipogenic progenitor (FAP) states in SkM including discovering and validating a novel CD140+/CD34+/SCA1-FAP population. Exercise- and obesity-regulated proportion, transcriptional and cell-cell interaction changes were most strongly pronounced in and centered around ASCs, FAPs, macrophages and T-cells. These changes reflected thermogenesis-vs-lipogenesis and hyperplasia-vs-hypertrophy shifts, clustered in pathways including extracellular matrix remodeling and circadian rhythm, and implicated complex single- and multi-tissue communication including training-associated shift of a cytokine from binding to its decoy receptor on ASCs to true receptor on M2 macrophages in vWAT. Overall, our work provides new insights on the metabolic protective effects of exercise training, uncovers a previously-underappreciated role of MSCs in mediating tissue-specific and multi-tissue effects, and serves as a model for multitissue single-cell analyses in physiologically complex and multifactorial traits exemplified by obesity and exercise training.

ABSTRACT Immune checkpoint blockade (ICB) therapy has improved long-term survival for patients with advanced melanoma. However, there is critical need to identify potential biomarkers of response and actionable strategies to improve response rates. Through generation and analysis of 148 chromatin modification maps for 36 melanoma samples from patients treated with anti-PD- 1, we identified significant enrichment of active enhancer states in non-responders at baseline. Analysis of an independent cohort of 20 samples identified a set of 437 enhancers that predicted response to anti-PD-1 therapy (Area Under the Curve of 0.8417). The activated non-responder enhancers marked a group of key regulators of several pathways in melanoma cells (including c- MET, TGFβ, EMT and AKT) that are known to mediate resistance to ICB therapy and several checkpoint receptors in T cells. Epigenetic editing experiments implicated involvement of c-MET enhancers in the modulation of immune response. Finally, inhibition of enhancers and repression of these pathways using bromodomain inhibitors along with anti-PD-1 therapy significantly decreased melanoma tumor burden and increased T-cell infiltration. Together, these findings identify a potential enhancer-based biomarker of resistance to anti-PD-1 and suggest enhancer blockade in combination with ICB as a potential strategy to improve responses.

ABSTRACT Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains one of the deadliest cancers. Uncovering mechanisms responsible for the heterogeneous clinical features of this disease is an essential step toward developing improved and more specific therapeutic approaches. Here, we sought to identify transcriptional regulators of aggressive PDAC growth through in vivo CRISPR screening of epigenetic and transcription factors in an orthotopic model. We identified the ISL LIM homeobox 2 ( ISL2 ) gene as a tumor suppressor whose depletion enhances the proliferation of human PDAC cells in vitro and in vivo and cooperates with activated KRAS to initiate PDAC in a murine model. Conversely, the upregulation of ISL2 expression through CRISPR-mediated locus-specific epigenetic editing results in reduced cell proliferation. Importantly, ISL2 is epigenetically silenced through DNA methylation in ~60% of PDAC tumors, which correlates with poor patient outcome. Functional studies showed that ISL2 loss rewires metabolic gene expression, and consequently potentiates oxidative phosphorylation while reducing glycolysis. This metabolic shift creates selective vulnerability to small molecule inhibitors of mitochondrial respiration and fatty acid oxidation. Collectively, these findings reveal ISL2 as a novel tumor suppressor whose inactivation drives metabolic reprogramming in an aggressive PDAC subset and point to potential therapeutic vulnerabilities in these tumors.

ABSTRACT Inguinal white adipose tissue (iWAT) is essential for the beneficial effects of exercise training on metabolic health. Extracellular matrix (ECM) composition, innervation, and vascularization are all important regulators of iWAT function, yet whether exercise training improves these structural components of iWAT is unknown. Using biochemical, imaging, and multi-omics analyses we find that 11-days of wheel running in male mice causes profound iWAT remodeling including decreased ECM deposition and increased vascularization and innervation. We identify adipose stem cells as the main contributors to training-induced ECM remodeling, determine that training causes a shift from hypertrophic to insulin-sensitive adipocyte subpopulations, show that the PRDM16 transcriptional complex is necessary for iWAT remodeling and beiging, and discover neuronal growth regulator 1 (NEGR1) as a link between PRDM16 and neuritogenesis. Exercise training leads to remarkable adaptations to iWAT structure and cell-type composition that can confer beneficial changes in tissue metabolism. Graphical Abstract

Mucosal melanoma (MM) is a deadly cancer derived from mucosal melanocytes. To test the consequences of MM genetics, we developed a zebrafish model in which all melanocytes experienced CCND1 expression and loss of PTEN and TP53. Surprisingly, melanoma only developed from melanocytes lining internal organs, analogous to the location of patient MM. We found that zebrafish MMs had a unique chromatin landscape from cutaneous melanoma. Internal melanocytes could be labeled using a MM-specific transcriptional enhancer. Normal zebrafish internal melanocytes shared a gene expression signature with MMs. Patient and zebrafish MMs have increased migratory neural crest gene and decreased antigen presentation gene expression, consistent with the increased metastatic behavior and decreased immunotherapy sensitivity of MM. Our work suggests the cell state of the originating melanocyte influences the behavior of derived melanomas. Our animal model phenotypically and transcriptionally mimics patient tumors, allowing this model to be used for MM therapeutic discovery.

B-type lamins are critical nuclear envelope proteins that interact with the 3D genomic architecture. However, identifying the direct roles of B-lamins on dynamic genome organization has been challenging as their joint depletion severely impacts cell viability. To overcome this, we engineered mammalian cells to rapidly and completely degrade endogenous B-type lamins using Auxin-inducible degron (AID) technology.Paired with a suite of novel technologies, live-cell Dual Partial Wave Spectroscopic (Dual-PWS) microscopy, in situ Hi-C, and CRISPR-Sirius, we demonstrate that lamin B1 and lamin B2 depletion transforms chromatin mobility, heterochromatin positioning, gene expression, and loci-positioning with minimal disruption to mesoscale chromatin folding. Using the AID system, we show that the disruption of B-lamins alters gene expression both within and outside lamin associated domains, with distinct mechanistic patterns depending on their localization. Critically, we demonstrate that chromatin dynamics, positioning of constitutive and facultative heterochromatic markers, and chromosome positioning near the nuclear periphery are significantly altered, indicating that the mechanism of action of B-type lamins is derived from their role in maintaining chromatin dynamics and spatial positioning.Our findings suggest that the mechanistic role of B-type lamins is stabilization of heterochromatin and chromosomal positioning along the nuclear periphery. We conclude that degrading lamin B1 and lamin B2 has several functional consequences related to both structural disease and cancer.

A central problem in cancer immunotherapy with immune checkpoint blockade (ICB) is the development of resistance, which affects 50% of patients with metastatic melanoma 1,2 . T cell exhaustion, resulting from chronic antigen exposure in the tumour microenvironment, is a major driver of ICB resistance 3 . Here, we show that CD38, an ecto-enzyme involved in nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) catabolism, is highly expressed in exhausted CD8 + T cells in melanoma and is associated with ICB resistance. Tumour-derived CD38 hi CD8 + T cells are dysfunctional, characterised by impaired proliferative capacity, effector function, and dysregulated mitochondrial bioenergetics. Genetic and pharmacological blockade of CD38 in murine and patient-derived organotypic tumour models (MDOTS/PDOTS) enhanced tumour immunity and overcame ICB resistance. Mechanistically, disrupting CD38 activity in T cells restored cellular NAD + pools, improved mitochondrial function, increased proliferation, augmented effector function, and restored ICB sensitivity. Taken together, these data demonstrate a role for the CD38-NAD + axis in promoting T cell exhaustion and ICB resistance, and establish the efficacy of CD38 directed therapeutic strategies to overcome ICB resistance using clinically relevant, patient-derived 3D tumour models.

Immune checkpoint inhibitors (ICIs) have heralded a remarkable shift in cancer care, significantly extending survival for advanced cancer patients. However, despite their remarkable clinical successes, a substantial majority of patients fail to achieve a lasting response to ICIs. To address this challenge and gain insights into the complex landscape of the tumor microenvironment (TME), we conducted an extensive analysis using single-cell RNA sequencing (scRNA; ~216K cells across 39 samples) and single-nucleus transposase-accessible chromatin sequencing (snATAC; ~43K cells from 15 samples) in a metastatic melanoma cohort. This systematic approach delineates 14 distinct cell types and 55 cell subtypes, including the identification of 15 transcriptional hallmarks of malignant cells. Through correlation analysis of cell subtype proportions, we unveiled six distinct clusters associated with varying tumor responses. Particularly intriguing was the identification of the mature DC enriched in immunoregulatory molecules (mregDC) subtype exhibiting correlations with naive T and B cells, forming an anti-tumor program that underscores the importance of multiple immune cell types in mediating anti-tumor immunity. Notably, we found that mregDC abundance represents a good prognostic predictor of progression-free survival (PFS) in the context of ICI treatment, and when combined with the TCF7+/- CD8 T cell ratio, it reliably predicts patient PFS across treatments beyond ICI. We validated our findings using an independent cohort of 274 ICI-treated melanoma samples analyzed using tissue-level expression. We next compared mregDCs and conventional dendritic cell types 1 and 2 (cDC1 and cDC2) using transcriptome signature, differentiation trajectory, interactome, cytokine milieu, and epigenome landscape analyses. This comparative analysis shed light on the unique attributes of mregDCs within the TME. Finally, we investigated cell type/subtype-specific genes, pathways, immune response enrichment, and ligand-receptor interactions closely associated with the proportions of mregDCs within the TME. These molecular and cellular insights, with their critical roles in enhancing the immune response against cancer, offer valuable prospects for predicting the efficacy of ICI regimens, and potentially guiding the selection of rational combinatorial therapies.