Cardiac macrophages are crucial for tissue repair after cardiac injury but are not well characterized. Here we identify four populations of cardiac macrophages. At steady state, resident macrophages were primarily maintained through local proliferation. However, after macrophage depletion or during cardiac inflammation, Ly6chi monocytes contributed to all four macrophage populations, whereas resident macrophages also expanded numerically through proliferation. Genetic fate mapping revealed that yolk-sac and fetal monocyte progenitors gave rise to the majority of cardiac macrophages, and the heart was among a minority of organs in which substantial numbers of yolk-sac macrophages persisted in adulthood. CCR2 expression and dependence distinguished cardiac macrophages of adult monocyte versus embryonic origin. Transcriptional and functional data revealed that monocyte-derived macrophages coordinate cardiac inflammation, while playing redundant but lesser roles in antigen sampling and efferocytosis. These data highlight the presence of multiple cardiac macrophage subsets, with different functions, origins, and strategies to regulate compartment size.

Although classified as hematopoietic cells, tissue-resident macrophages (MFs) arise from embryonic precursors that seed the tissues prior to birth to generate a self-renewing population, which is maintained independently of adult hematopoiesis. Here we reveal the identity of these embryonic precursors using an in utero MF-depletion strategy and fate-mapping of yolk sac (YS) and fetal liver (FL) hematopoiesis. We show that YS MFs are the main precursors of microglia, while most other MFs derive from fetal monocytes (MOs). Both YS MFs and fetal MOs arise from erythro-myeloid progenitors (EMPs) generated in the YS. In the YS, EMPs gave rise to MFs without monocytic intermediates, while EMP seeding the FL upon the establishment of blood circulation acquired c-Myb expression and gave rise to fetal MOs that then seeded embryonic tissues and differentiated into MFs. Thus, adult tissue-resident MFs established from hematopoietic stem cell-independent embryonic precursors arise from two distinct developmental programs.

Haematopoietic stem cell (HSC) function is known to degrade with age; here, replication stress is shown to be a potent driver of the functional decline of HSCs during physiological ageing in mice due to decreased expression of mini-chromosome maintenance helicase components and reduced activity of the DNA replication machinery. Emmanuelle Passegué and colleagues have studied how haematopoietic stem-cell (HSC) function degrades with age by focusing on the role of DNA damage. They find that replication stress — aberrant replication causing DNA replication forks to slow or stall — is a potent driver of the functional decline of HSCs during physiological ageing. Cell-cycle defects and chromosome gaps or breaks become more frequent, associated with reduced expression of mini-chromosome maintenance helicase components of the DNA replication machinery of old HSCs. Haematopoietic stem cells (HSCs) self-renew for life, thereby making them one of the few blood cells that truly age1,2. Paradoxically, although HSCs numerically expand with age, their functional activity declines over time, resulting in degraded blood production and impaired engraftment following transplantation2. While many drivers of HSC ageing have been proposed2,3,4,5, the reason why HSC function degrades with age remains unknown. Here we show that cycling old HSCs in mice have heightened levels of replication stress associated with cell cycle defects and chromosome gaps or breaks, which are due to decreased expression of mini-chromosome maintenance (MCM) helicase components and altered dynamics of DNA replication forks. Nonetheless, old HSCs survive replication unless confronted with a strong replication challenge, such as transplantation. Moreover, once old HSCs re-establish quiescence, residual replication stress on ribosomal DNA (rDNA) genes leads to the formation of nucleolar-associated γH2AX signals, which persist owing to ineffective H2AX dephosphorylation by mislocalized PP4c phosphatase rather than ongoing DNA damage. Persistent nucleolar γH2AX also acts as a histone modification marking the transcriptional silencing of rDNA genes and decreased ribosome biogenesis in quiescent old HSCs. Our results identify replication stress as a potent driver of functional decline in old HSCs, and highlight the MCM DNA helicase as a potential molecular target for rejuvenation therapies.

Plasma fibronectin promotes modulation of rat arterial smooth muscle cells from a contractile to a synthetic phenotype during the first few days in primary culture. This process includes cell adhesion and spreading, loss of myofilaments, and formation of a widespread rough endoplasmic reticulum and a prominent Golgi complex. The structural reorganization is accompanied by activation of overall RNA and protein synthesis. Moreover, the cells gain the ability to replicate their DNA and divide in response to platelet-derived growth factor. Here, it is demonstrated that the power of fibronectin to bring about this change in the differentiated properties of the smooth muscle cells resides in a 105-kD cell-binding fragment, whereas a 70-kD collagen-binding fragment and a 31-kD heparin-binding fragment are inactive in this respect. Laminin, another adhesive glycoprotein and a component of the basement membrane that normally surrounds arterial smooth muscle, was contrarily found to maintain the cells in a contractile phenotype. However, with increasing time more and more cells went through the modulation into a synthetic phenotype. This "catch-up" was counteracted by a peptide that contained the cell-attachment sequence of fibronectin (Arg-Gly-Asp-Ser). Hence, it is possible that the delayed modulation on laminin was due to production of fibronectin by the cells themselves. In support of this notion, fibronectin isolated from smooth muscle cultures was found to be as effective as plasma fibronectin in stimulating the phenotypic modulation. Moreover, using a combination of chemical, immunochemical, and immunocytochemical methods, it was demonstrated that the cells secreted fibronectin as well as laminin at an increasing rate during the first 4 d in primary culture and, notably, cells cultured on laminin produced more fibronectin than cells cultured on fibronectin. Newly synthesized fibronectin was incorporated into a network of pericellular and intercellular fibrils, whereas laminin formed a more diffuse layer covering the cells in a basement membrane-like manner. Taken together, the findings suggest diverse roles for fibronectin and laminin in the control of the differentiated properties of arterial smooth muscle cells. They further indicate that the ability of arterial smooth muscle cells to produce fibronectin and laminin early in primary culture is not directly related to the phenotypic state as determined morphologically and by measurement of overall rates of RNA and protein synthesis. This may be due to the cells being able to sense the macromolecular composition of the pericellular matrix and to modify their secretory activity accordingly.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)

Abstract Adult hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) respond directly to inflammation and infection, resulting in both acute and persistent changes to quiescence, mobilization, and differentiation. Here we show that fetal HSPCs respond to prenatal inflammation in utero , and that the fetal response shapes postnatal hematopoiesis and immunity. Heterogenous fetal HSPCs showed divergent responses to maternal immune activation (MIA), including changes in quiescence, expansion, and lineage-biased output. Single cell transcriptomic analysis of fetal HSPCs in response to MIA revealed specific upregulation of inflammatory gene profiles in discrete, transient HSC populations, that propagated expansion of lymphoid-biased progenitors. Beyond fetal development, MIA caused the inappropriate expansion and persistence of fetal lymphoid-biased progenitors postnatally, concomitant with increased cellularity and hyperresponsiveness of fetal-derived innate-like lymphocytes. Our investigation demonstrates how inflammation in utero can direct the trajectory of output and function of fetal-derived immune cells by reshaping fetal HSC establishment.

Abstract Respiratory diseases are a leading cause of death worldwide, with highly varied vulnerability to disease between individuals. The underlying reasons of disease susceptibility are unknown, but often include a variable immune response in lungs. Recently, we identified a surprising novel role of the interleukin 7 receptor (IL7R), a primarily lymphoid-associated regulator, in fetal-specified, lung-resident macrophage development. Here, we report that traditional, hematopoietic stem cell-derived myeloid cells in the adult lung, peripheral blood, and bone marrow also depend on IL7R expression. Using single and double germline knockout models, we found that eosinophil numbers were reduced upon deletion of IL7Rα. We then employed two Cre recombinase models in lineage tracing experiments to test whether these cells developed through an IL7Rα+ pathway. Despite the impact of IL7Rα deletion, IL7R-Cre labeled only a minimal fraction of eosinophils. We therefore examined the intrinsic versus extrinsic requirement for IL7R in the production of eosinophils using reciprocal hematopoietic stem cell transplantation assays. These assays revealed that extrinsic, but not eosinophil-intrinsic, IL7R is required for eosinophil reconstitution by HSCs in the adult lung. To determine which external factors may be influencing eosinophil development and survival, we performed a cytokine array analysis between wild-type and IL7Rα-deficient mice and found several differentially regulated proteins. These findings expand upon our previous publication that IL7R is required not only for proper lymphoid cell development and homeostasis, but also for myeloid cell homeostasis in tissues. Highlights Loss of IL7Rα resulted in significantly fewer eosinophils in adult mice IL7R-Cre lineage tracing revealed minimal labeling of eosinophils IL7Rα-deficient HSCs robustly reconstituted eosinophils in a WT host WT HSCs failed to fully reconstitute eosinophils in IL7Rα -/- hosts Several cytokines are differentially expressed in WT and IL7Rα-deficient mice

SUMMARY Platelet dysregulation is drastically increased with advanced age and contributes to making cardiovascular disorders the leading cause of death of elderly humans. Hematopoietic stem and progenitor cells continuously give rise to platelets, but their contributions to variable platelet production and activity throughout life remain unclear. Here we reveal a direct differentiation pathway from hematopoietic stem cells into platelets that is unique to aging. An unequivocal genetic lineage tracing mouse model demonstrated that this age-specific pathway is progressively propagated over time. Remarkably, the age-specific platelet path is decoupled from all other hematopoietic lineages, including erythropoiesis, and operates as an additional layer in parallel with canonical platelet production. This results in two molecularly and functionally distinct populations of megakaryocyte progenitor cells that that operate in parallel. The age-specific megakaryocyte progenitor population has profoundly enhanced capacity to engraft, expand, and reconstitute platelets, and produces an additional platelet population that exists only in old mice. Consistent with increased thrombotic incidence upon aging, the two pools of co-existing platelets contribute to age-related thrombocytosis and dramatically increased thrombosis in vivo . Upon acute, platelet-specific stress, the age-specific MkPs endowed old mice with superior capacity to rapidly restore platelet counts. These findings reveal stem cell-based aging as a mechanism for platelet dysregulation and identify an aging-induced population of functionally enhanced MkPs as a unique source of age-specific platelets. >HIGHLIGHTS Aging leads to two parallel platelet specification paths from HSCs The shortcut platelet pathway is perpetuated by highly expansive MkPs unique to aging The age-specific differentiation path contributes to thrombosis and platelet hyperreactivity Age-specific MkPs serve as potent first responders to acute platelet loss

Abstract The respiratory system exists at the interface between our body and the surrounding non-sterile environment; therefore, it is critical for a state of homeostasis to be maintained through a balance of pro- and anti- inflammatory cues. An appropriate inflammatory response is vital for combating pathogens, while an excessive or uncontrolled inflammatory response can lead to the development of chronic diseases. Recent studies show that actively transcribed noncoding regions of the genome are emerging as key regulators of biological processes, including inflammation. LincRNA-Cox2 is one such example of an inflammatory inducible long noncoding RNA functioning to control immune response genes. Here using bulk and single cell RNA-seq, in addition to florescence activated cell sorting, we show that lincRNA-Cox2 is most highly expressed in the lung, particularly in alveolar macrophages where it functions to control immune gene expression following acute lung injury. Utilizing a newly generated lincRNA-Cox2 transgenic overexpressing mouse, we show that it can function in trans to control genes including Ccl3, 4 and 5. This work greatly expands our understanding of the role for lincRNA-Cox2 in host defense and sets in place a new layer of regulation in RNA-immune-regulation of genes within the lung.

Abstract RNA-seq is a powerful technique to investigate and quantify entire transcriptomes. Recent advances in the field have made it possible to explore the transcriptomes of single cells. However, most widely used RNA-seq protocols fail to provide crucial information regarding transcription start sites. Here we present a protocol, Tn5Prime, that takes advantage of the Tn5 transposase based Smartseq2 protocol to create RNA-seq libraries that capture the 5’ end of transcripts. The Tn5Prime method dramatically streamlines the 5’ capture process and is both cost effective and reliable. By applying Tn5Prime to bulk RNA and single cell samples we were able to define transcription start sites as well as quantify transcriptomes at high accuracy and reproducibility. Additionally, similar to 3’ end based high-throughput methods like Drop-Seq and 10X Genomics Chromium, the 5’ capture Tn5Prime method allows the introduction of cellular identifiers during reverse transcription, simplifying the analysis of large numbers of single cells. In contrast to 3’ end based methods, Tn5Prime also enables the assembly of the variable 5’ ends of antibody sequences present in single B-cell data. Therefore, Tn5Prime presents a robust tool for both basic and applied research into the adaptive immune system and beyond.

Abstract Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation is the paradigm for stem cell therapies. The protocol described here enables quantitative assessment of the body-wide HSPC reconstitution of different mature hematopoietic cells in mice based on their presence in circulating blood. The method determines donor-derived mature cell populations per mouse, over time, by quantitatively obtaining their absolute numbers in the peripheral blood and utilizing previously assessed tissue-distribution factors. A Markov-based birth/death computational model accounts for the drastic differences in mature cell half-lives. By quantifying the number of cells produced and eliminating host variability, the protocol can be used to directly compare the lineage output of different types of HSPCs on a per cell basis, thereby clarifying the lineage potential and expansion capacity of different cell populations. These protocols were developed for hematopoiesis, but can readily be extended to other contexts by simply replacing the cell types and distributions. Highlights Quantitative assessment of stem and progenitor cell reconstitution capacity Elimination of cell-specific recipient variability for accurate donor cell potential Directly comparable lineage output within and between stem and progenitor cells Blood-based absolute quantification of whole-body repopulation over time Markov modelling-based consideration of differential mature cell half-lives