Background A chikungunya virus outbreak of unprecedented magnitude is currently ongoing in Indian Ocean territories. In Réunion Island, this alphavirus has already infected about one-third of the human population. The main clinical symptom of the disease is a painful and invalidating poly-arthralgia. Besides the arthralgic form, 123 patients with a confirmed chikungunya infection have developed severe clinical signs, i.e., neurological signs or fulminant hepatitis. Methods and Findings We report the nearly complete genome sequence of six selected viral isolates (isolated from five sera and one cerebrospinal fluid), along with partial sequences of glycoprotein E1 from a total of 127 patients from Réunion, Seychelles, Mauritius, Madagascar, and Mayotte islands. Our results indicate that the outbreak was initiated by a strain related to East-African isolates, from which viral variants have evolved following a traceable microevolution history. Unique molecular features of the outbreak isolates were identified. Notably, in the region coding for the non-structural proteins, ten amino acid changes were found, four of which were located in alphavirus-conserved positions of nsP2 (which contains helicase, protease, and RNA triphosphatase activities) and of the polymerase nsP4. The sole isolate obtained from the cerebrospinal fluid showed unique changes in nsP1 (T301I), nsP2 (Y642N), and nsP3 (E460 deletion), not obtained from isolates from sera. In the structural proteins region, two noteworthy changes (A226V and D284E) were observed in the membrane fusion glycoprotein E1. Homology 3D modelling allowed mapping of these two changes to regions that are important for membrane fusion and virion assembly. Change E1-A226V was absent in the initial strains but was observed in >90% of subsequent viral sequences from Réunion, denoting evolutionary success possibly due to adaptation to the mosquito vector. Conclusions The unique molecular features of the analyzed Indian Ocean isolates of chikungunya virus demonstrate their high evolutionary potential and suggest possible clues for understanding the atypical magnitude and virulence of this outbreak.

Article12 February 2004free access Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation Stéphane Bressanelli Stéphane Bressanelli Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, France Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria Search for more papers by this author Karin Stiasny Karin Stiasny Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria Search for more papers by this author Steven L Allison Steven L Allison Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria Search for more papers by this author Enrico A Stura Enrico A Stura Departement d'Ingénierie et d'Etudes des Protéines, CEA Saclay, Gif-sur-Yvette, France Search for more papers by this author Stéphane Duquerroy Stéphane Duquerroy Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, France Search for more papers by this author Julien Lescar Julien Lescar Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, FrancePresent address: School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 1 Nanyang Walk, Block 5, Singapore 637616, Singapore Search for more papers by this author Franz X Heinz Corresponding Author Franz X Heinz Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria Search for more papers by this author Félix A Rey Corresponding Author Félix A Rey Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, France Search for more papers by this author Stéphane Bressanelli Stéphane Bressanelli Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, France Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria Search for more papers by this author Karin Stiasny Karin Stiasny Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria Search for more papers by this author Steven L Allison Steven L Allison Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria Search for more papers by this author Enrico A Stura Enrico A Stura Departement d'Ingénierie et d'Etudes des Protéines, CEA Saclay, Gif-sur-Yvette, France Search for more papers by this author Stéphane Duquerroy Stéphane Duquerroy Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, France Search for more papers by this author Julien Lescar Julien Lescar Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, FrancePresent address: School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 1 Nanyang Walk, Block 5, Singapore 637616, Singapore Search for more papers by this author Franz X Heinz Corresponding Author Franz X Heinz Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria Search for more papers by this author Félix A Rey Corresponding Author Félix A Rey Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, France Search for more papers by this author Author Information Stéphane Bressanelli1,2, Karin Stiasny2, Steven L Allison2, Enrico A Stura3, Stéphane Duquerroy1, Julien Lescar1, Franz X Heinz 2 and Félix A Rey 1 1Virologie Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, IFR 115, Gif-sur-Yvette, France 2Institute of Virology, University of Vienna, Vienna, Austria 3Departement d'Ingénierie et d'Etudes des Protéines, CEA Saclay, Gif-sur-Yvette, France *Corresponding authors. Institute of Virology, University of Vienna, Kinderspitalgasse 15, A1095, Vienna, Austria. Tel.: +43 1 40490 79510; Fax: +43 1 40490 9795; E-mail: [email protected] Moléculaire & Structurale, CNRS UMR 2472/INRA UMR 1157, Avenue de la Terrasse, Gif-sur-Yvette Cedex, France. Tel.: +33 1 6982 3844; Fax: +33 1 6982 4308; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2004)23:728-738https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600064 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Enveloped viruses enter cells via a membrane fusion reaction driven by conformational changes of specific viral envelope proteins. We report here the structure of the ectodomain of the tick-borne encephalitis virus envelope glycoprotein, E, a prototypical class II fusion protein, in its trimeric low-pH-induced conformation. We show that, in the conformational transition, the three domains of the neutral-pH form are maintained but their relative orientation is altered. Similar to the postfusion class I proteins, the subunits rearrange such that the fusion peptide loops cluster at one end of an elongated molecule and the C-terminal segments, connecting to the viral transmembrane region, run along the sides of the trimer pointing toward the fusion peptide loops. Comparison with the low-pH-induced form of the alphavirus class II fusion protein reveals striking differences at the end of the molecule bearing the fusion peptides, suggesting an important conformational effect of the missing membrane connecting segment. Introduction Controlled fusion between different membrane-bound compartments at the right time and space is central to the organization of all living organisms. This process is tightly controlled by specific proteins that interact with each other and with lipids, as well as with other proteins, to form a complex at the fusion site (reviewed in Jahn et al, 2003). Enveloped viruses also use membrane fusion for cell entry, and have evolved virus-specific fusion proteins that mediate the merging of viral and cellular membranes. These fusion proteins contain a special segment of their polypeptide chain, termed ‘fusion peptide’, that becomes exposed during the conformational change and is inserted into the target membrane. At least two different structural classes of viral membrane fusion proteins, displaying a completely different molecular architecture, have been described. Pioneering structural studies on the influenza virus hemagglutinin (Wilson et al, 1981) and on other functionally and structurally related viral envelope proteins, collectively termed as class I fusion proteins (reviewed in Weissenhorn et al, 1999; Colman and Lawrence, 2003), have provided major breakthroughs for understanding the mechanisms used to drive the membrane fusion reaction. Class I fusion proteins form trimeric spikes in their native metastable conformation at the surface of infectious virions. Their postfusion conformation is a hairpin-like structure in which both the fusion peptide (near the N-terminus) and the membrane anchor (near the C-terminus) are juxtaposed at the same end of a very stable protein rod. The class II fusion proteins, E of flaviviruses (Rey et al, 1995; Modis et al, 2003) and E1 of alphaviruses (Lescar et al, 2001), have been shown to be homologous in spite of the absence of sequence conservation, and display a molecular architecture completely different from that of class I proteins. The fusion peptide is internal, contained in a loop between two β-strands. The structural alignment of the flavivirus tick-borne encephalitis virus (TBEV) envelope protein E and the alphavirus Semliki Forest virus fusion protein E1 (SFV E1) provided in Figure 1 summarizes the domain organization as well as the secondary structure nomenclature used for the class II proteins. These proteins are synthesized and folded in a metastable form as a complex with a second, ‘chaperone’ viral envelope protein—prM (precursor of M) in the case of flavi and pE2 (precursor of E2) in the case of alphaviruses. Proteolytic cleavage of the chaperone (instead of cleavage of the fusion protein itself, as in the case of class I viral fusion proteins) lowers the energy barrier between the metastable state and the final, lowest energy conformation of the fusion protein, thus priming them to trigger membrane fusion. Both flavivirus and alphavirus virions are icosahedral assemblies, the surface of which is a continuous protein lattice of E homodimers (Kuhn et al, 2002) and E1/E2 heterodimers (Lescar et al, 2001; Zhang et al, 2002), respectively, with the fusion peptide loop buried in the respective dimer interfaces. Both viruses enter target cells by receptor-mediated endocytosis (Wahlberg and Garoff, 1992; Allison et al, 1995), with the receptor recognition function carried by the fusion protein itself in flaviviruses and by the companion E2 protein in alphaviruses. Exposure to the acidic pH of the endosomes triggers a major conformational change of the virion's surface, involving dissociation of the native protein complexes (which destroys the surface icosahedral lattice), and the formation of homotrimers of the fusion proteins (reviewed in Heinz and Allison, 2000; Kielian et al, 2000). The energy released during the transition from the metastable dimers at the viral surface to the very stable target-membrane-inserted homotrimers is used to drive the merging of the viral and cellular membranes. This conversion also occurs in solution with solubilized E dimers (Stiasny et al, 1996). Figure 1.Structural alignment of the class II membrane fusion proteins TBEV E and SFV E1. The secondary structure, domain nomenclature and color coding follow the definitions used for the TBEV sE dimer (Rey et al, 1995). A color-coded bar below the sequence indicates domains dI, dII, and dIII in red, yellow, and blue, respectively. The fusion peptide loop is colored orange and segments in between domains are purple (the dI/dIII and dIII/stem linkers). Highly conserved residues are given on a green background (note the similar pattern of conservation within the two viruses). A gray semitransparent bar overlays the C-terminal segments that are not part of the crystal structures. The secondary structure elements are indicated above the sequence, with arrows and helices for β-strands and α-helices, respectively. In the stem region, the predicted α-helices (H1, H2, TM1, and TM2) are indicated in gray above the sequence, and only apply to the top TBEV sequence. The corresponding segments in alphaviruses are indicated by s1, s2, and TM below the sequence. The actual transmembrane regions of the proteins are framed in red. The structural alignment was obtained using the DALI server with the three domains separately, using the low-pH-induced trimeric conformation of the two proteins. Structurally equivalent amino acids in the two proteins are boxed. A few important insertions are indicated above the sequence in TBEV E (i1, i2, and i3, in pale red) and below for SFV E1 (i1′ and i2′, in dark green). The insertion in between residues 204 and 209 in TBEV (in the fg loop) is also an insertion in tick-borne with respect to mosquito-borne flaviviruses, and therefore is not marked. The i3 insertion in TBEV E is indicated by broken lines since this segment is α helical in flaviviruses and extended in alphaviruses (shown by stretching the residues so that only every third or fourth amino acid in E1 has its counterpart in E in this region of the alignment). The i1′ and i2′ insertions in SFV E1 occur downstream of the two α-helices observed in dII, at regions of contact with s1, and are postulated to compensate for the less bulky s1 region compared to H1. Download figure Download PowerPoint TBEV as well as several mosquito-borne flaviviruses, like dengue, yellow fever, Japanese encephalitis, and West Nile viruses, are important human pathogenic viruses. The flavivirus E polypeptide chain contains about 500 amino acids. The structure of the TBEV E ectodomain (termed sE and containing about 400 residues) has shown that the E subunits are elongated rods that associate in an antiparallel fashion, leading to a brick-shaped dimer with the C-termini at either end (Rey et al, 1995). Infectious virions contain 90 dimers at their surface, forming a smooth protein shell completely covering the viral membrane (Kuhn et al, 2002). The sE ectodomain is responsible for the lateral contacts between dimers at the viral surface. The viral membrane-interacting segment of the protein contains roughly the 100 C-terminal amino acids that immediately follow sE in the amino-acid sequence. This segment is folded as four α-helices that have been visualized by electron cryomicroscopy (cryo EM) and image reconstruction of mature dengue virus particles (Zhang et al, 2003a). The first two helices are amphipathic and lie flat on the viral membrane, interacting with the lipid heads of the outer leaflet of the lipid bilayer. This region of the protein is called the ‘stem’ (Allison et al, 1999). The third and fourth α-helices traverse the membrane as an antiparallel coiled-coil. Exposure of the soluble sE fragment to low pH leads to a reversible dissociation of the dimer, resulting in exposure of the fusion peptide loops but not to trimerization as on the virion envelope (Stiasny et al, 1996). However, as initially shown for the soluble ectodomain of SFV E1 (Klimjack et al, 1994), when the low-pH treatment is carried out in the presence of liposomes, the interaction of the fusion peptide loops with lipids triggers an irreversible trimerization of sE, which remains stably membrane associated (Stiasny et al, 2002). Solubilization from the liposomes with nonionic detergents allowed the isolation, biochemical characterization, and crystallization of this sE trimer (Stiasny et al, 2004). We describe here the crystal structure of the ectodomain of the TBEV E protein in its low-pH-induced trimeric form. Results and discussion Structural transition from dimer to trimer The crystal structure determination is described in the Materials and methods section, and the relevant statistics are given in Table I. The structure of the trimeric low-pH form of sE shows that the conformational change reorients the molecule from a horizontal, antiparallel dimeric conformation to a vertical trimer in which the subunits display a parallel arrangement (Figure 2). The fusion peptide loops (in orange) are exposed at one end of the trimer, but retain a conformation similar to that observed in the structure of the dimer. Their main chains expose a number of polar groups to solvent, indicating that they are not likely to insert deeply into the lipid bilayer, but would instead interact mostly with the lipid heads of the outer leaflet, as diagrammed in Figure 2B, lower panel. This is consistent with the measurements of the molecule made in electron micrographs of liposomes containing TBEV sE trimers at their surface (Stiasny et al, 2004). The aromatic residues W101 and F108 of the fusion peptide loop, which in the neutral-pH form are buried in the dI/dIII pocket at the dimer interface (Rey et al, 1995), are exposed in the trimer, presumably interacting with disordered detergent molecules in the crystal, and with the aliphatic moiety of the lipid bilayer on membranes. Figure 2.Conformational rearrangement of protein E. Comparison of the overall organization of the protein in the neutral- and acid-pH forms. The ‘top’ and ‘side’ views are indicated in the top and bottom rows, respectively. The three domains of sE are labeled dI, dII, and dIII. The color coding is defined in the legend to Figure 1. (A) Neutral–pH, dimeric conformation of sE in a surface representation. The carbohydrate residues (labeled CHO) are indicated in pink. A ribbon diagram is intercalated between the top and side views, at the same scale and orientation as the foreground subunit in the side view. Several β-sheets that are referred to in the text are indicated (i.e., the top and bottom β-sheets of dI, the klD0 and gfeah sheets of dII). In the ribbon diagram, the arrows representing the β-strands in the bottom sheet of dI are white. The last amino acid observed in the crystal structure (K395; Rey et al, 1995) is indicated by an open blue star, labeled C-term. The lipid bilayer is diagrammed at the same scale underneath the dimer in the side view, with the aliphatic region in pale yellow and the lipid head regions in gray. (B) Low-pH conformation of sE. As in panel A, only one subunit is colored and the others are shown in white and gray. The arrows show the dimensions of the molecule, including all atoms with a Van der Waals radius of 2 Å. In the side view, the purple region indicates the dIII/stem linker, which ends at the last amino acid visible in the electron density map (R401) indicated by an open red star (labeled C-ter). Note the vertical groove that follows the C-terminus along the interface between neighboring dIIs in the trimer. The lipid bilayer is diagrammed as in (A), indicating the postulated interaction of the fusion peptide loops with the lipid heads. (C) Ribbon diagram of the polypeptide chain of sE in the trimeric conformation. In the top view, note the extended conformation of the dI/dIII linker (purple). In the side view, only the colored subunit displayed in (B) is shown for clarity. The disordered segments (the E0F0 loop in dI and the fg loop in dII) are indicated by broken lines and labeled. The C-terminus is indicated as in (B). It shows that the predicted α-helix H1 of the stem would interact with the two short helices of dII. (D) Conformational rearrangement of sE. dI of the sE subunit in the conformation observed in the dimer (Figure 1A) was superposed on dI of the colored subunit in the trimer shown in (C), as explained in the text. Curved gray arrows show the movement of the domains to reach the conformation indicated in (C). In the side view, the two β-sheets of dII that change their relative orientation are labeled (klD0 and gfeah). Download figure Download PowerPoint Table 1. Summary of crystallographic dataa Crystal form O1 O2 T Space group P212121 P21212 P4222 Cell dimensions (Å) a=121.5 a=120.4 a=b=127.6 b=142.9 b=180.6 c=224.6 c=173.6 c=68.5 Number of molecules per asymmetric unit 6 3 3 Maximum resolution (Å) 2.7 (2.8–2.7) 3.2 (3.1–3.2) 3.5b (3.6–3.5) Number of observations 306 381 105 296 113 305 Rsym (%) 11.1 (45.5) 11.2 (39.0) 13.1 (42.9) I/σ(I) 5.4 (2.0) 9.7 (3.7) 9.5 (4.0) Resolution range for refinement (Å)c 40–2.7 30–3.2 30–3.5 Number of reflections 80 896 25 236 24 110 Completeness (%) 96.9 (83.9) 99.8 (100) 99.8 (99.7) Rfact (%) 20.6 (31.6) 29.7 27.8 Rfree (%) 24.2 (34.0) 32.8 29.0 rms deviation, bond lengths (Å) 0.007 0.009 0.010 rms deviation, bond angles (deg) 1.4 1.5 1.6 a Values for the outermost resolution shell are shown in parentheses. Rsym=∑h∑j∣Ih, j−〈Ih〉∣/∑h∑jIh,j, where 〈Ih〉 is the average intensity of the j observations of the reflection of unique index h. Rfact=∑h∣∣Fobs∣−k∣Fcalc∣∣/∑h∣Fobs∣ for the 76 806 reflections used in refinement; Rfree was calculated with the same formula for a random 4090 reflections not used in refinement. b Anisotropic, 3.8 Å along a*, 3 Å along c*. c For crystal forms O2 and T, a single round of positional refinement and group B factor refinement was performed after molecular replacement with the refined structure determined with form O1. Noncrystallographic symmetry constraints were enforced. Importantly, in the conformational transition, the individual domains of sE rearrange such that the C-terminal segment, including dIII, runs along the sides of the trimer toward the fusion peptide loops. The sE C-terminus (indicated by an open red star in Figures 2B and C, lower panel, at the end of the dIII/stem linker) is located about mid-way. The conformation of the molecule suggests that in the postfusion form of full-length E, the stem will continue to reach the lipid bilayer such that the TM helices and the fusion peptide loops will be juxtaposed. This overall arrangement is analogous to that observed in the postfusion form of class I fusion proteins (Weissenhorn et al, 1999), suggesting a common mechanism to appose the two different lipid bilayers in the first step of membrane fusion. In contrast to class I, however, no major refolding of the protein takes place during the fusogenic rearrangement, with the individual domains retaining their original fold, as summarized in Table II. For an easier visualization of the change in conformation within the sE polypeptide, we have compared it to the neutral-pH form by artificially holding dI constant and referring all the domain movements to it, as shown in Figure 2D. For this purpose, the sE subunit in the conformation observed in the dimer was superimposed on dI in the trimer, and the trimer axis was used to assemble artificially a trimer of sE subunits in the neutral-pH conformation through similar dI/dI contacts. Figure 2 shows that the relative arrangement of dII with respect to dI is similar in the two forms (compare the lower panels of Figures 2C and D), except for a rotation of dII of 19° about the dI/dII junction, which results in a straight 105 Å long rod formed by dI and dII (measured between Cα atoms at the two ends as indicated in Figure 2C). In contrast, the relative dI/dIII orientation is radically different, with dIII now lying on a side of the trimer, with its C-terminal end and the dIII/stem linker projecting toward dII. In the trimeric form, the β-strands of the Ig-like dIII run roughly parallel to the strands of dI, whereas they were nearly orthogonal in the neutral-pH form. The center of mass of dIII is displaced by 33 Å. In spite of this dramatic change in the environment of dIII, its internal structure changes the least among the three domains in both conformations, as indicated by the small rms deviation (0.6 Å) obtained when directly superposing dIII from the two forms (Table II). In contrast, the dI/dIII linker, which comprises residues 296–310 (in purple), stretches considerably to reach the new position of dIII in the acid form. Table 2. Pairwise superposition of domainsa Structures compared domains superposed TBEa/TBEnb TBEa/SFVa TBEn/SFVn dI dII dIII DI dII dIII dI dII dIII No. of equivalent Cα 90 82 91 78 157 77 75 158 75 rmsdc (Å) 2.1 1.4 0.6 2.3 3.7 3.3 2.5 3.5 2.9 a The superposition was made using the Dali server, http://www.ebi.ac.uk/dali/. The PDB accession numbers of the coordinates used are TBEa, 1URZ; TBEn, 1SVB; SFVa, 1RER; SFVn, 1I9W, except for dIII the coordinates of which will be deposited along with submission of a manuscript (J Lescar and FA Rey, in preparation), describing the refined model of the SFV E1 protein in its neutral-pH form and its interactions in the viral particle. b a, acidic-pH form; n, neutral-pH form. c rmsd=root mean squared deviation. In addition to the important change in the orientation of dIII and the accompanying stretching of the dI/dIII linker, several changes take place in dI and at the dI/dII interface. Two loops are disordered: the E0F0 loop of dI, which carries the single N-linked glycosylation site of TBEV E, and the fg loop in dII, which contains a six-residue insertion in all tick-borne flaviviruses with respect to the mosquito-borne flaviviruses. These two loops are indicated in Figure 2A, C and D. The rms deviation of the individual superpositions (Table II) shows that in the conformational change the internal structure of dI changes most, and that of dII is intermediate. The changes in dI are best described by comparing to the corresponding changes in dI from SFV E1 and will be dealt with in a later section. In dII, the 19° rotation with respect to dI results from a sliding of the two apposed β-sheets near the dI/dII junction, the klDO and gfeah sheets (labeled in Figure 2). This region overlaps with the area of alternative conformation observed in the dengue virus sE protein structure at neutral pH in the presence of detergent (Modis et al, 2003), where the kl β-hairpin switches to the gfeah sheet to create a hydrophobic pocket that accommodates the aliphatic chain of the detergent. Interactions that must break in the neutral-pH form to allow the dIII rearrangement Examination of the dimer contacts shows that only a few of the amino acids involved are conserved among flaviviruses, except for those in the fusion peptide loop, as shown in Figure 3A. In contrast, the region of contacts between dI and dIII within the subunit in the dimer does exhibit a conserved patch across the domain interface, displayed in Figure 3B. The surface buried by dIII in the dimer is 970 Å2, of which 750 Å2 belongs to contacts with dI in the same polypeptide chain and the remainder to the interaction with the fusion peptide loop across the dimer interface. The dI/dIII interaction involves a number of Van der Waals contacts, salt bridges, and direct and water-mediated hydrogen bonds that have to be broken in the transition from dimer to trimer. Figure 3C shows a stereo view of the details of these interactions. It shows, in particular, a salt bridge between the strictly conserved residues R9 (from dI) and E373 (from dIII). It also shows the presence in the contact area of two strictly conserved histidine residues, H323 from dIII and H146 from dI, which are involved in hydrogen bonds with the main chain of the opposite domain across the interface. Protonation of these histidine residues is likely to be an important factor in the destabilization of this interface upon lowering the pH, since the transition is triggered at a pH of about 6.5, near the pK of this amino acid. Figure 3.Comparison of the intra-oligomeric and intra-subunit contacts of E before and after the low-pH-induced conformational change. The interactions within the dimeric form are indicated in panels A–C and those in the trimeric form in D–F. In the surface representations of panels A, B, D, and E, the contact regions are indicated in yellow, with the patches formed by conserved residues in orange. Conserved residues outside the contact area are shown in dark gray. The domains are labeled as in Figure 2. (A) sE dimer contacts. The foreground subunit of the dimer, in the side orientation shown in Figure 2A, bottom panel, was removed to show its imprint on the subunit in the background. Except for the fusion peptide loop (labeled with W101), the dimer contact area is essentially made by nonconserved residues. (B) dI/dIII contact surface within the sE dimer. The subunit in (A) was rotated by about 45° about a vertical axis passing through the dI/dIII interface. dIII was then cut out and rotated by 180° about the same axis to show the interaction surface. Note the strong orange patch of conserved residues on both interacting surfaces. Some residues are labeled to allow comparison with the area involved in contacts in the trimeric form. (C) Stereo diagram showing the interactions between dI and dIII across the interface shown in (B). On the left, a square superposed on the ribbon diagram of the sE dimer indicates the region corresponding to the enlargement shown on the right. The polypeptide backbone is shown as ribbons colored according to domains, and gray for the neighboring subunit. The side chains are shown as ball and stick, colored according to atom type (nitrogen: blue; oxygen: red; carbon: light red for dI, light blue for dIII, gray for the adjacent subunit). Water molecules trapped at the interface are shown as red spheres. Hydrogen bonds are indicated as broken cyan lines. The amino acids involved in the contact are labeled, with conserved residues underlined. The secondary structure elements are labeled in white, following Figure 1. (D) sE trimer contacts. The orientation corresponds to that of the subunit in the foreground in Figure 2B, lower panel, which has been rotated 180° about the vertical axis, to show the regions involved in contacts (thus, dIII is on the left). Note the discontinuity of contacts in the central part of dII. Most of the conserved residues have been labeled. Note their distribution at the periphery of the contact area. (E) Contacts made by dIII and the dIII/stem linker in the trimer. The orientation of the trimer is the same as that shown in Figure 2B, lower panel. dIII and the dIII/stem linker were cut from the trimer and rotated by 180° about a vertical axis, shown on the right. Note that the face of dIII involved in the contacts is the same one that faces dI in the dimer (compare the location of H323 and P360, labeled in both panels B and D). The surface of contact of the dIII/stem linker is shown in purple (as well as the residues in the body of the trimer that contact it) with conserved residues colored pink. dI′ and dII′ label the contacted domains from the adjacent subunit (in gray in Figure 2). (F) The ribbons diagram of the left indicates the region of the enlargement shown on the stereo diagram of the right, which depicts the interactions at the interface displayed in (E), the lower half. The color coding is as in (C), with the main chain of the dIII/stem linker in purple, and its side chains as ball and sticks with carbon atoms colored pink. Note the same conserved histidine residue seen in (C) (H323) as being part of the new set of interactions with dI. Note the proximity of helices αA and αB of dII to the C-terminus (R401) of sE, which in the intact molecule would bring them into contact with helix H1. Download figure Download PowerPoint Trimer contacts The total buried surface of each subunit in the trimer is roughly 4000 Å2. Figure 3D shows a discontinuous contact surface, divided into two patches at either end of the subunit. The most important patch at the top corresponds to the bottom sheet of the dI β-barrel

The human seasonal coronavirus HKU1-CoV, which causes common colds worldwide, relies on the sequential binding to surface glycans and transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2) for entry into target cells. TMPRSS2 is synthesized as a zymogen that undergoes autolytic activation to process its substrates. Several respiratory viruses, in particular coronaviruses, use TMPRSS2 for proteolytic priming of their surface spike protein to drive membrane fusion upon receptor binding. We describe the crystal structure of the HKU1-CoV receptor binding domain in complex with TMPRSS2, showing that it recognizes residues lining the catalytic groove. Combined mutagenesis of interface residues and comparison across species highlight positions 417 and 469 as determinants of HKU1-CoV host tropism. The structure of a receptor-blocking nanobody in complex with zymogen or activated TMPRSS2 further provides the structural basis of TMPRSS2 activating conformational change, which alters loops recognized by HKU1-CoV and dramatically increases binding affinity.

ABSTRACT The human seasonal coronavirus HKU1-CoV, which causes common colds worldwide, relies on the sequential binding to a cell-surface glycan and to TMPRSS2 for entry into target cells. TMPRSS2 is a cell surface protease synthesized as a zymogen that undergoes autolytic activation to process its substrates. Several respiratory viruses - in particular coronaviruses - use TMPRSS2 for proteolytic priming of their surface spike protein to drive membrane fusion upon receptor binding. We describe the crystal structure of the HKU1-CoV receptor binding domain in complex with TMPRSS2, showing that it recognizes residues lining the catalytic groove. Combined mutagenesis of interface residues and comparison across species highlight positions 417 and 469 as determinants of HKU1-CoV host tropism. The structure of a receptor- blocking nanobody in complex with zymogen or activated TMPRSS2 further provides the structural basis of the TMPRSS2 activating conformational change, altering loops recognized by HKU1-CoV and dramatically increasing its binding affinity.

ABSTRACT Flavivirus particles bud in the ER of infected cells as immature virions composed of 180 heterodimers of glycoproteins prM and E, associated as 60 (prM/E) 3 trimeric spikes. Exposure to the mildly acidic pH of the TGN results in dissociation of the trimeric spikes followed by reassociation of the prM/E protomers into 90 dimers organized in a characteristic herringbone pattern. The furin site in prM is exposed in the dimers for maturation of prM into M and pr. For flaviviruses such as the tick-borne encephalitis virus (TBEV) as well as for dengue virus, it was shown that at neutral pH pr loses affinity for E, such that it dissociates from the mature particle as soon as it reaches the external milieu, which is at neutral pH. Using a soluble recombinant form of E (sE) and pr from yellow fever virus (YFV), we show here that the affinity of pr for recombinant E protein remains high even at neutral pH. The X-ray structure of YFV pr/sE shows more extensive inter-chain hydrogen bonding than does the dengue or TBEV, and also that it retains the charge complementarity between the interacting surfaces of the two proteins even at neutral pH. We further show that pr blocks sE flotation with liposomes when exposed at low pH at a 1:1 stoichiometry, yet in the context of the virus particle, an excess of 10:1 pr:E ratio is required to block virus/liposome fusion. In aggregate, our results show that the paradigm obtained from earlier studies of other flaviviruses does not apply to yellow fever virus, the flavivirus type species. A mechanism that does not rely solely in a change in the environmental pH is thus required for the release of pr from the mature particles upon release from infected cells. These results open up new avenues to understand the activation mechanism that yields mature, infectious YFV particles.