Abstract Purpose: Gene expression–based molecular subtypes of high-grade serous tubo-ovarian cancer (HGSOC), demonstrated across multiple studies, may provide improved stratification for molecularly targeted trials. However, evaluation of clinical utility has been hindered by nonstandardized methods, which are not applicable in a clinical setting. We sought to generate a clinical grade minimal gene set assay for classification of individual tumor specimens into HGSOC subtypes and confirm previously reported subtype-associated features. Experimental Design: Adopting two independent approaches, we derived and internally validated algorithms for subtype prediction using published gene expression data from 1,650 tumors. We applied resulting models to NanoString data on 3,829 HGSOCs from the Ovarian Tumor Tissue Analysis consortium. We further developed, confirmed, and validated a reduced, minimal gene set predictor, with methods suitable for a single-patient setting. Results: Gene expression data were used to derive the predictor of high-grade serous ovarian carcinoma molecular subtype (PrOTYPE) assay. We established a de facto standard as a consensus of two parallel approaches. PrOTYPE subtypes are significantly associated with age, stage, residual disease, tumor-infiltrating lymphocytes, and outcome. The locked-down clinical grade PrOTYPE test includes a model with 55 genes that predicted gene expression subtype with >95% accuracy that was maintained in all analytic and biological validations. Conclusions: We validated the PrOTYPE assay following the Institute of Medicine guidelines for the development of omics-based tests. This fully defined and locked-down clinical grade assay will enable trial design with molecular subtype stratification and allow for objective assessment of the predictive value of HGSOC molecular subtypes in precision medicine applications. See related commentary by McMullen et al., p. 5271

Abstract Ovarian carcinosarcoma (OCS) is an aggressive and rare tumour type with limited treatment options. OCS is hypothesised to develop via the combination theory from a single progenitor, resulting in carcinomatous and sarcomatous components, or alternatively via the conversion theory, with the sarcomatous component developing from the carcinomatous component through epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). We show OCS from 18 women to be monoclonal through analysis of DNA variants from isolated carcinoma and sarcoma components. RNA sequencing indicated the carcinoma components were more mesenchymal when compared with pure ovarian carcinomas, supporting the conversion theory. We used pre-clinical OCS models to test the efficacy of microtubule-targeting drugs, including eribulin, which has been shown to reverse EMT characteristics. We demonstrated that microtubule inhibitors, vinorelbine and eribulin, were more effective than standard-of-care platinum-based chemotherapy. Eribulin reduced mesenchymal characteristics, N-MYC expression and cholesterol biosynthesis. Finally, eribulin induced a strong immune response, supporting immunotherapy combinations in the clinic.

Abstract Ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originates in the fallopian tube, with secretory cells carrying a TP53 mutation, known as ‘p53 signatures’, identified as potential precursors. p53 signatures evolve into serous tubal intraepithelial carcinomas (STIC) lesions, which, in turn, progress into invasive HGSC that readily spread to the ovary and disseminate around the peritoneal cavity. We recently investigated the genomic landscape of early- and late-stage HGSC and found higher ploidy in late-stage (median 3.1) than early-stage (median 2.0) samples. Here, to explore whether the high ploidy and possible whole genome duplication observed in late-stage disease are determined early in the evolution of HGSC, we analysed archival formalin-fixed paraffin-embedded samples (FFPE) from five HGSC patients. p53 signatures and STIC lesions were laser-capture microdissected and sequenced using shallow whole genome sequencing (sWGS), while invasive ovarian/fallopian tube and metastatic carcinoma samples underwent macrodissection and were profiled using both sWGS and targeted next generation sequencing. Results showed highly similar patterns of global copy number change between STIC lesions and invasive carcinoma samples within each patient. Ploidy changes were evident in STIC lesions, but not p53 signatures, and there was strong correlation between ploidy in STIC lesions and invasive ovarian/fallopian tube and metastatic samples in each patient. The reconstruction of sample phylogeny for each patient from relative copy number indicated that high ploidy, when present, occurred early in the evolution of HGSC, which was further validated by copy number signatures in ovarian and metastatic tumours. These findings suggest that aberrant ploidy, suggestive of whole genome duplication, arises early in HGSC, and is detected in STIC lesions, implying that the trajectory of HGSC may be determined at the earliest stages of tumour development.

Abstract Ovarian high grade serous carcinoma (HGSC) remains a disease of poor prognosis that is unresponsive to current immune checkpoint inhibitors. Although PI3K pathway alterations are common in HGSC, attempts to target this pathway have been unsuccessful. We hypothesised aberrant PI3K pathway activation may alter the HGSC immune microenvironment and present a novel targeting strategy. We used both murine models and HGSC patient samples to study the impact of loss of Pten , a negative regulator of PI3K pathway signalling. We identified populations of resident macrophages specifically in Pten null omental tumours. These macrophages derive from peritoneal fluid macrophages and have a unique gene expression programme, marked by high levels of HMOX1 expression, the gene for the enzyme heme oxygenase-1. Targeting resident peritoneal macrophages prevents appearance of HMOX1 hi macrophages and in doing so reduces tumour growth. Furthermore, direct inhibition of HMOX1 extends survival in vivo . HMOX1 hi macrophages with corresponding gene expression programmes are also identified in human HGSC tumours and their presence correlates with activated tumoural PI3K pathway/mTOR signalling and poor overall survival in HGSC patients. In contrast, tumours with low number of HMOX1 hi macrophages are marked by increased adaptive immune response gene expression. Our data suggest that HMOX1 hi macrophages represent a potential therapeutic target and biomarker for poor prognosis HGSC.

Abstract Deciphering the structural variation across tumour genomes is crucial to determine the events driving tumour progression and better understand tumour adaptation and evolution. High grade serous ovarian cancer (HGSOC) is an exemplar tumour type showing extreme, but poorly characterised structural diversity. We comprehensively describe the mutational landscape driving HGSOC, exploiting a large (N=324), deeply whole genome sequenced dataset. We reveal two divergent evolutionary trajectories, affecting patient survival and involving differing genomic environments. One involves homologous recombination repair deficiency (HRD) while the other is dominated by whole genome duplication (WGD) with frequent chromothripsis, breakage-fusion-bridges and extra-chromosomal DNA. These trajectories contribute to structural variation hotspots, containing novel candidate driver genes with significantly altered expression. While structural variation predominantly drives tumorigenesis, we also find high mtDNA mutation loads associated with shorter patient survival, and acting in combination with alterations in the nuclear genome to impact prognosis and suggesting new strategies for patient stratification.

Chromosomal aberration and DNA copy number change are robust hallmarks of cancer. Imaging of spots generated using fluorescence in situ hybridisation (FISH) of locus specific probes is routinely used to detect copy number changes in tumour nuclei. However, it often does not perform well on solid tumour tissue sections, where partially represented or overlapping nuclei are common. To overcome these challenges, we have developed a computational approach called FrenchFISH, which comprises a nuclear volume correction method coupled with two types of Poisson models: either a Poisson model for improved manual spot counting without the need for control probes; or a homogenous Poisson Point Process model for automated spot counting. We benchmarked the performance of FrenchFISH against previous approaches in a controlled simulation scenario and exemplify its use in 12 ovarian cancer FFPE-tissue sections, for which we assess copy number alterations in three loci (c-Myc, hTERC and SE7). We show that FrenchFISH outperforms standard spot counting approaches and that the automated spot counting is significantly faster than manual without loss of performance. FrenchFISH is a general approach that can be used to enhance clinical diagnosis on sections of any tissue.

Abstract High grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) is characterised by poor outcome and extreme chromosome instability (CIN). Therapies targeting centrosome amplification (CA), a key mediator of chromosome missegregation and CIN, may have significant clinical utility in HGSOC. However, the prevalence of CA in HGSOC, its relationship to genomic biomarkers of CIN and its potential impact on therapeutic response have not been defined. Using high-throughput multi-regional microscopy on 287 clinical HGSOC tumour tissues and 73 ovarian cancer cell lines, we show that CA through centriole overduplication is a highly recurrent and heterogeneous feature of HGSOC and is strongly associated with CIN and genome subclonality. Cell-based studies showed that high prevalence CA is phenocopied in ovarian cancer cell lines, and that high CA is associated with increased multi-treatment resistance; most notably to paclitaxel which is the most common treatment used in HGSOC. CA in HGSOC may therefore present a potential driver of tumour evolution and a powerful biomarker for response to standard-of-care treatment.

Abstract Ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) prognosis correlates directly with presence of intratumoral lymphocytes. However, cancer immunotherapy has yet to achieve meaningful survival benefit in patients with HGSC. Epigenetic silencing of immunostimulatory genes is implicated in immune evasion in HGSC and re-expression of these genes could promote tumour immune clearance. We discovered that simultaneous inhibition of the histone methyltransferases G9A and EZH2 activates the CXCL10-CXCR3 axis and increases homing of intratumoral effector lymphocytes and natural killer cells whilst suppressing tumour-promoting FoxP3 + CD4 T cells. The dual G9A/EZH2 inhibitor HKMTI-1-005 induced chromatin changes that resulted in the transcriptional activation of immunostimulatory gene networks, including the re-expression of elements of the ERV-K endogenous retroviral family. Importantly, treatment with HKMTI-1-005 improved the survival of mice bearing Trp53 -/- null ID8 ovarian tumours and resulted in tumour burden reduction. These results indicate that inhibiting G9A and EZH2 in ovarian cancer alters the immune microenvironment and reduces tumour growth and therefore positions dual inhibition of G9A/EZH2 as a strategy for clinical development. Abstract Figure

Genomic complexity from profound copy-number aberration has prevented effective molecular stratification of ovarian and other cancers. Here we present a method for copy-number signature identification that decodes this complexity. We derived eight signatures using 117 shallow whole-genome sequenced high-grade serous ovarian cancer cases, which were validated on a further 497 cases. Mutational processes underlying the copy-number signatures were identified, including breakage-fusion-bridge cycles, homologous recombination deficiency and whole-genome duplication. We show that most tumours are heterogeneous and harbour multiple signature exposures. We also demonstrate that copy number signatures predict overall survival and changes in signature exposure observed in response to chemotherapy suggest potential treatment strategies.