This paper presents standards and best practices for reporting genome sequences of uncultivated viruses. We present an extension of the Minimum Information about any (x) Sequence (MIxS) standard for reporting sequences of uncultivated virus genomes. Minimum Information about an Uncultivated Virus Genome (MIUViG) standards were developed within the Genomic Standards Consortium framework and include virus origin, genome quality, genome annotation, taxonomic classification, biogeographic distribution and in silico host prediction. Community-wide adoption of MIUViG standards, which complement the Minimum Information about a Single Amplified Genome (MISAG) and Metagenome-Assembled Genome (MIMAG) standards for uncultivated bacteria and archaea, will improve the reporting of uncultivated virus genomes in public databases. In turn, this should enable more robust comparative studies and a systematic exploration of the global virosphere.

The family Circoviridae contains viruses with covalently closed, circular, single-stranded DNA (ssDNA) genomes, including the smallest known autonomously replicating, capsid-encoding animal pathogens. Members of this family are known to cause fatal diseases in birds and pigs and have been historically classified in one of two genera: Circovirus, which contains avian and porcine pathogens, and Gyrovirus, which includes a single species (Chicken anemia virus). However, over the course of the past six years, viral metagenomic approaches as well as degenerate PCR detection in unconventional hosts and environmental samples have elucidated a broader host range, including fish, a diversity of mammals, and invertebrates, for members of the family Circoviridae. Notably, these methods have uncovered a distinct group of viruses that are closely related to members of the genus Circovirus and comprise a new genus, Cyclovirus. The discovery of new viruses and a re-evaluation of genomic features that characterize members of the Circoviridae prompted a revision of the classification criteria used for this family of animal viruses. Here we provide details on an updated Circoviridae taxonomy ratified by the International Committee on the Taxonomy of Viruses in 2016, which establishes the genus Cyclovirus and reassigns the genus Gyrovirus to the family Anelloviridae, a separate lineage of animal viruses that also contains circular ssDNA genomes. In addition, we provide a new species demarcation threshold of 80% genome-wide pairwise identity for members of the family Circoviridae, based on pairwise identity distribution analysis, and list guidelines to distinguish between members of this family and other eukaryotic viruses with circular, ssDNA genomes.

Accurate indicators of fecal pollution are needed in order to minimize public health risks associated with wastewater contamination in recreational waters. However, the bacterial indicators currently used for monitoring water quality do not correlate with the presence of pathogens. Here we demonstrate that the plant pathogen Pepper mild mottle virus (PMMoV) is widespread and abundant in wastewater from the United States, suggesting the utility of this virus as an indicator of human fecal pollution. Quantitative PCR was used to determine the abundance of PMMoV in raw sewage, treated wastewater, seawater exposed to wastewater, and fecal samples and/or intestinal homogenates from a wide variety of animals. PMMoV was present in all wastewater samples at concentrations greater than 1 million copies per milliliter of raw sewage. Despite the ubiquity of PMMoV in human feces, this virus was not detected in the majority of animal fecal samples tested, with the exception of chicken and seagull samples. PMMoV was detected in four out of six seawater samples collected near point sources of secondary treated wastewater off southeastern Florida, where it co-occurred with several other pathogens and indicators of fecal pollution. Since PMMoV was not found in nonpolluted seawater samples and could be detected in surface seawater for approximately 1 week after its initial introduction, the presence of PMMoV in the marine environment reflects a recent contamination event. Together, these data demonstrate that PMMoV is a promising new indicator of fecal pollution in coastal environments.

Summary Reclaimed water use is an important component of sustainable water resource management. However, there are concerns regarding pathogen transport through this alternative water supply. This study characterized the viral community found in reclaimed water and compared it with viruses in potable water. Reclaimed water contained 1000‐fold more virus‐like particles than potable water, having approximately 10 8 VLPs per millilitre. Metagenomic analyses revealed that most of the viruses in both reclaimed and potable water were novel. Bacteriophages dominated the DNA viral community in both reclaimed and potable water, but reclaimed water had a distinct phage community based on phage family distributions and host representation within each family. Eukaryotic viruses similar to plant pathogens and invertebrate picornaviruses dominated RNA metagenomic libraries. Established human pathogens were not detected in reclaimed water viral metagenomes, which contained a wealth of novel single‐stranded DNA and RNA viruses related to plant, animal and insect viruses. Therefore, reclaimed water may play a role in the dissemination of highly stable viruses. Information regarding viruses present in reclaimed water but not in potable water can be used to identify new bioindicators of water quality. Future studies will need to investigate the infectivity and host range of these viruses to evaluate the impacts of reclaimed water use on human and ecosystem health.

ABSTRACT Metagenomics has enabled the rapid, unbiased detection of microbes across diverse sample types, leading to exciting discoveries in infectious disease, microbiome, and viral research. However, the analysis of metagenomic data is often complex and computationally resource-intensive. CZ ID is a free, cloud-based genomic analysis platform that enables researchers to detect microbes using metagenomic data, identify antimicrobial resistance genes, and generate viral consensus genomes. With CZ ID, researchers can upload raw sequencing data, find matches in NCBI databases, get per-sample taxon metrics, and perform a variety of analyses and data visualizations. The intuitive interface and interactive visualizations make exploring and interpreting results simple. Here, we describe the expansion of CZ ID with a new long read mNGS pipeline that accepts Oxford Nanopore generated data ( czid.org ). We report benchmarking of a standard mock microbial community dataset against Kraken2, a widely used tool for metagenomic analysis. We evaluated the ability of this new pipeline to detect divergent viruses using simulated datasets. We also assessed the detection limit of a spiked-in virus to a cell line as a proxy for clinical samples. Lastly, we detected known and novel viruses in previously characterized disease vector (mosquitoes) samples.

Abstract Because parasites have an inextricable relationship with their host, they have the potential to serve as viral reservoirs or facilitate virus host-shifts. Yet, little is known about viruses infecting parasitic hosts except for blood-feeding arthropods that are well-known vectors of zoonotic viruses. Herein we uncover viruses of flatworms (Phylum Platyhelminthes, group Neodermata) that specialize in parasitizing vertebrates and their ancestral free-living relatives. We discovered 115 novel viral sequences, including 1 in Macrostomorpha, 5 in Polycladida, 44 in Tricladida, 1 in Monogenea, 15 in Cestoda and 49 in Trematoda, through data mining. The majority of newly identified viruses constitute novel families or genera. Phylogenetic analyses show that the virome of flatworms changed dramatically during the transition of Neodermatans to a parasitic lifestyle. Most Neodermatan viruses seem to co-diversify with their host, with the exception of rhabdoviruses which may switch host more often, based on phylogenetic relationships. Neodermatan rhabodviruses also have an ancestral position to vertebrate-associated viruses, including Lyssaviruses, suggesting that vertebrate rhabdoviruses emerged from a flatworm rhabdovirus in a parasitized host. This study reveals an extensive diversity of viruses in Platyhelminthes and highlights the need to evaluate the role of viral infection in flatworm-associated diseases.

The genus Potexvirus includes many species known to infect terrestrial plants and, more recently, a novel species, Turtlegrass virus X (TVX) infecting the seagrass Thalassia testudinum. We designed a degenerate primer pair, Potex7F and Potex7-RC, to amplify a 584 nt RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) fragment from potexviruses infecting seagrasses. This primer pair was modified from Potex5/Potex2-RC primers published in 2002 that target terrestrial plant potexviruses, by including nucleotide bases found in TVX and related potexvirus sequences identified in seagrass viromes from Tampa Bay, Florida, USA. Using this newly developed primer set, we performed a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) survey to screen for potexviruses in 63 opportunistically collected, apparently healthy seagrass samples. The survey examined the host species T. testudinum, Halodule wrightii, Halophila stipulacea, Syringodium filiforme, Ruppia maritima, and Zostera marina. PCR products were successfully amplified and sequenced from T. testudinum samples collected around Florida, USA, indicating prevailing potexvirus infection in the region.

Antimicrobial resistant (AMR) pathogens represent urgent threats to human health, and their surveillance is of paramount importance. Metagenomic next generation sequencing (mNGS) has revolutionized such efforts, but remains challenging due to the lack of open-access bioinformatics tools capable of simultaneously analyzing both microbial and AMR gene sequences. To address this need, we developed the Chan Zuckerberg ID (CZ ID) AMR module, an open-access, cloud-based workflow designed to integrate detection of both microbes and AMR genes in mNGS and whole-genome sequencing (WGS) data. It leverages the Comprehensive Antibiotic Resistance Database and associated Resistance Gene Identifier software, and works synergistically with the CZ ID short-read mNGS module to enable broad detection of both microbes and AMR genes. We highlight diverse applications of the AMR module through analysis of both publicly available and newly generated mNGS and WGS data from four clinical cohort studies and an environmental surveillance project. Through genomic investigations of bacterial sepsis and pneumonia cases, hospital outbreaks, and wastewater surveillance data, we gain a deeper understanding of infectious agents and their resistomes, highlighting the value of integrating microbial identification and AMR profiling for both research and public health. We leverage additional functionalities of the CZ ID mNGS platform to couple resistome profiling with the assessment of phylogenetic relationships between nosocomial pathogens, and further demonstrate the potential to capture the longitudinal dynamics of pathogen and AMR genes in hospital acquired bacterial infections. In sum, the new AMR module advances the capabilities of the open-access CZ ID microbial bioinformatics platform by integrating pathogen detection and AMR profiling from mNGS and WGS data. Its development represents a critical step toward democratizing pathogen genomic analysis and supporting collaborative efforts to combat the growing threat of AMR.

Turtlegrass virus X, which infects the seagrass Thalassia testudinum , is the only potexvirus known to infect marine flowering plants. We investigated potexvirus distribution in seagrasses using a degenerate reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay originally designed to capture potexvirus diversity in terrestrial plants. The assay, which implements Potex-5 and Potex-2RC primers, successfully amplified a 584 nt RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) fragment from TVX-infected seagrasses. Following validation, we screened 74 opportunistically collected, apparently healthy seagrass samples for potexviruses using this RT-PCR assay. The survey examined the host species T. testudinum , Halodule wrightii , Halophila stipulacea , Syringodium filiforme , Ruppia maritima , and Zostera marina . Potexvirus PCR products were successfully generated only from T. testudinum samples and phylogenetic analysis of sequenced PCR products revealed five distinct TVX sequence variants. Although the RT-PCR assay revealed limited potexvirus diversity in seagrasses, the expanded geographic distribution of TVX shown here emphasizes the importance of future studies to investigate T. testudinum populations across its native range and understand how the observed fine-scale genetic diversity affects host-virus interactions.

Parasitic flatworms (Neodermata) represent a public health and economic burden due to associated debilitating diseases and limited therapeutic treatments available. Despite their importance, there is scarce information regarding flatworm-associated microbes. We report the discovery of six RNA viruses in the cestode Schistocephalus solidus. None were closely related to classified viruses and they represent new taxa. Mining transcriptomic data revealed the broad distribution of these viruses in Alaskan and European S. solidus populations. We demonstrate through in vitro culture of S. solidus that five of these viruses are vertically transmitted. With experimental infections and field-sampling, we show that one of the viruses is transmitted to parasitized hosts. The impact of these viruses in parasite fitness and pathogenicity, and in host-parasite co-evolutionary dynamics remains to be determined. The detection of six novel viruses in this first characterization of viruses in Neodermatans likely represents a fraction of virus diversity in parasitic flatworms.