Abstract 14-3-3 proteins are among the most abundant proteins in the brain and bind a large number of proteins in a phosphorylation dependent manner, including proteins prone to aggregate in neurodegenerative diseases. Binding of 14-3-3 is reported to facilitate the function, promote solubility, and coordinate the assembly of client proteins. For the microtubule-associated protein Tau, a neuronal client of 14-3-3, we show that phosphorylation-dependent stoichiometric binding of 14-3-3ζ dimers inhibits Tau assembling into biomolecular condensates, prevents its aggregation, and realizes efficient dissociation of Tau from microtubules. In contrast, at sub-stoichiometric 14-3-3 concentrations, multivalent electrostatic interactions promote the co-condensation of 14-3-3ζ with Tau in a phosphorylation-independent manner, offering an additional level in regulating the interactions of both proteins. These findings offer long-sought mechanistic insights into how 14-3-3 proteins regulate substrate solubility and highlight their importance for maintaining Tau protein functionality in the brain.

Abstract There is a growing demand for covalent tool compounds and chemical probes to investigate and perturb protein function and dysregulation. The combination of a covalent electrophile with a peptide or protein-based scaffold with an extended binding footprint enables the targeting of shallow protein surfaces, not typically addressable using small molecules. However, to fully exploit the potential of electrophilic proteins or peptides there is a need for versatile approaches to convert native peptide sequences into covalent binders that can target a broad range of residues. Here we report protein-based thio-methacrylate esters - electrophiles with a diverse reactivity profile that can be installed easily on unprotected peptides and proteins via cysteine side chains, and react efficiently and selectively with cysteine and lysine side chains on the target. Guided by computational modeling, we designed and synthesized methacrylate phosphopeptides derived from 14-3-3-binding proteins and demonstrated these peptides irreversibly label 14-3-3σ via either lysine or cysteine residues, depending on the position of the electrophile. Methacrylate peptides targeting a conserved lysine residue exhibited pan-isoform binding of 14-3-3 proteins, and efficiently labeled 14-3-3 proteins in lysates, as well as secreted 14-3-3 extracellularly. The irreversible binding to the predicted target lysines were confirmed by proteomics and X-ray crystallography of the complexes. Finally, we applied this approach to develop protein-based covalent binders. A methacrylate-modified variant of the colicin E9 immunity protein irreversibly bound to the E9 DNAse, resulting in significantly higher thermal stability relative to the non-covalent complex. Our approach offers a simple and versatile route to convert peptides and proteins into potent covalent binders.

Engineered living materials have the potential for wide-ranging applications such as biosensing and treatment of diseases. Programmable cells provide the functional basis for living materials, however, their release into the environment raises numerous biosafety concerns. Current designs that limit the release of genetically engineered cells typically involve the fabrication of multi-layer hybrid materials with sub-micron porous matrices. Nevertheless the stringent physical barriers limit the diffusion of macromolecules and therefore the repertoire of molecules available for actuation in response to communication signals between cells and their environment. Here, we engineer a first-of-its-kind living material entitled ‘Platform for Adhesin-mediated Trapping of Cells in Hydrogels’ (PATCH). This technology is based on engineered E. coli that displays an adhesion protein derived from an Antarctic bacterium with high affinity for glucose. The adhesin stably anchors E. coli in dextran-based hydrogels with large pore diameters (10-100 μm) and reduces the leakage of bacteria into the environment by up to 100-fold. As an application of PATCH, we engineered E. coli to secrete lysostaphin via the Type 1 Secretion System and demonstrated that living materials containing this E. coli inhibit the growth of S. aureus , including the strain resistant to methicillin (MRSA). Our tunable platform allows stable integration of programmable cells in dextran-based hydrogels without compromising free diffusion of macromolecules and could have potential applications in biotechnology and biomedicine.