ABSTRACT Repeated adaptive divergence in replicates of phenotypic diversification offers a propitious context to identify the molecular bases associated to adaptive divergence. A currently hotly debated topic pertains to the relative role of genomic vs. epigenomic variation in shaping patterns of phenotypic variation at the gene expression level. Here, we combined genomic, epigenomic and transcriptomic information from 64 individuals in order to quantify the relative role of SNPs and DNA methylation variation in the repeated evolution of four limnetic-benthic whitefish species pairs from Europe and North America. We first found evidence for 149 convergent differentially methylated regions (DMRs) between species across continents, which significantly influenced levels of gene expression. Hyper-methylated DMRs in the limnetic species were globally associated to an expression repression relatively to benthic species, and inversely. Furthermore, we identified 108 convergent genetic variants (eQTLs) associated to gene expression differences between species. Gene expression differences were more pronounced in genes harbouring eQTL compared to those associated with DMRs, thus revealing a greater effect of eQTLs on gene expression. Multivariate analyses allowed partitioning the relative contribution of epi-/genomic changes and their association to gene expression variation. Most of the gene expression variation was significantly explained by genomic (4.1%) and putatively genomic-epigenomic interactive variation (46.7%), while “pure” epigenomic variation explained marginally 2.3% of the gene expression variation across continents. This study provides a rare qualitative and quantitative documentation of the relative role of genomic, DNA methylation and their interaction in shaping patterns of convergent gene expression during the process of ecological speciation.

Abstract Parallel divergence patterns across replicated species pairs occurring in similar environmental contrasts may arise through distinct evolutionary scenarios. Deciphering whether such parallelism actually reflects repeated parallel divergence driven by divergent selection or a single divergence event with subsequent gene flow needs to be ascertained. Reconstructing historical gene flow is therefore of fundamental interest to understand how demography and selection jointly shaped genomic divergence during speciation. Here, we use an extended modeling framework to explore the multiple facets of speciation-with-gene-flow with demo-genetic divergence models that capture both temporal and genomic variation in effective population size and migration rate. We investigate the divergence history of five sympatric Lake Whitefish limnetic (dwarf) and benthic (normal) species pairs characterized by variable degrees of ecological divergence and reproductive isolation. Genome-wide SNPs were used to document the extent of genetic differentiation in each species pair, and 26 divergence models were fitted and compared to the unfolded joint allele frequency spectrum of each pair. We found evidence that a recent (circa 3000-4000 generations) asymmetrical secondary contact between expanding post-glacial populations has accompanied Whitefish diversification. Our results suggest that heterogeneous genomic differentiation patterns have emerged through the combined effects of linked selection generating variable rates of lineage sorting across the genome during geographical isolation, and heterogeneous introgression eroding divergence at different rates across the genome upon secondary contact. This study thus provides a new retrospective insight into the historical demographic and selective processes that shaped a continuum of divergence associated with ecological speciation.

Abstract Phenotypic diversification and speciation are classically associated with genetic differentiation and gene expression variation. However, increasing evidence suggests that epigenetic mechanisms like DNA methylation may contribute to species divergence due to their effects on transcription and phenotype. Methylation can also increase mutagenesis and could lead to genetic assimilation of plastic phenotypes into genetic variants when the environment remains stable over many generations, though there has been minimal empirical research on assimilation. Whitefish are excellent systems to study speciation and genetic assimilation due to the repeated independent divergence of benthic-limnetic species pairs that have coexisted in lakes for ~12 000 years serving as natural replicates. Here we investigate whole genome genetic and epigenetic differentiation between benthic-limnetic species pairs in lake whitefish ( Coregonus clupeaformis ) and European whitefish ( C. lavaretus ) from four lakes (N=64). We found considerable, albeit variable, genetic and epigenetic differences between benthic and limnetic species in all four lakes. Polymorphism was enriched at CpG sites confirming the mutagenic nature of DNA methylation; all SNP types were enriched in all lakes, though C > T SNPs were most common. We also identified a surplus of potential sites undergoing genetic assimilation putatively associated with speciation, defined as sites harbouring both a differentially methylated site and a highly divergent SNP. Our results support the hypothesis that DNA methylation contributes to phenotypic divergence, influences mutagenesis, and drives genetic assimilation of phenotypes that are ultimately associated with ecological speciation in whitefish species complexes.

Abstract Nascent pairs of ecologically differentiated species offer an opportunity to get a better glimpse at the genetic architecture of speciation. Of particular interest is our recent ability to consider a wider range of genomic variants, not only single-nucleotide polymorphisms (SNPs), thanks to long-read sequencing technology. We can now identify structural variants (SVs) like insertions, deletions, and other rearrangements, allowing further insights into the genetic architecture of speciation and how different types of variants are involved in species differentiation. Here, we investigated genomic patterns of differentiation between sympatric species pairs (Dwarf and Normal) belonging to the Lake Whitefish ( Coregonus clupeaformis ) species complex. We assembled the first reference genomes for both C. clupeaformis sp. Normal and C. clupeaformis sp. Dwarf, annotated the transposable elements, and analysed the genomes in the light of related coregonid species. Next, we used a combination of long-read and short-read sequencing to characterize SVs and genotype them at population-scale using genome-graph approaches, showing that SVs cover five times more of the genome than SNPs. We then integrated both SNPs and SVs to investigate the genetic architecture of species differentiation in two different lakes and highlighted an excess of shared outliers of differentiation. In particular, a large fraction of SVs differentiating the two species correspond to insertions or deletions of transposable elements (TEs), suggesting that TE accumulation may represent a key component of genetic divergence between the Dwarf and Normal species. Altogether, our results suggest that SVs may play an important role in speciation and that, by combining second and third generation sequencing, we now have the ability to integrate SVs into speciation genomics.

Abstract The molecular mechanisms underlying intraspecific variation in life history strategies are still poorly understood, despite the importance of this question for understanding of organism’s responses to environmental variability. Theoretical work proposed that epigenetic mechanisms such as DNA methylation might regulate intraspecific variation in life history strategies, however this assumption has rarely been verified empirically in wild populations. We examined associations between genome-wide methylation changes and environmentally-driven life history variation in two lineages of a marine fish that diverged approximatively 2.5 Mya, the capelin ( Mallotus villosus ), from North America and Europe. In both lineages, capelin harbour two contrasted life history strategies: some are strictly semelparous, experience fast actuarial senescence, but benefit from high hatching success by spawning on demersal sites where water temperature is low and relatively stable. In contrast, others are facultative iteroparous, have slower actuarial senescence, and suffer from lower hatching success by breeding in the intertidal zone where temperature is warmer, thermohaline parameters are less stable, and egg desiccation risk is high. Performing whole genome and epigenome sequencing, we showed that these contrasted life history strategies are more likely governed by epigenetic changes than by differences in DNA sequence. While genetic differentiation between the capelin harbouring different life history strategies was negligible, we detected parallel genome-wide methylation changes across lineages. We identified 1,067 differentially methylated regions (DMRs) comprising 15,818 CpGs, with 22% of them located within 5-kb around genes comprising promotor regions. We found that all DMRs were hypermethylated in demersal-spawning individuals. This striking result suggests that lower water temperature at demersal sites leads to an overall hypermethylation of the genome determined during the epigenetic reprogramming occurring over embryonic development. Our study emphasizes that parallel epigenetics changes in lineages with divergent genetic background could have a functional role in the regulation of intraspecific life history variation.

In contrast to the plethora of studies focusing on the genomic basis of adaptive phenotypic divergence, the role of gene expression during speciation has been much less investigated and consequently, less understood. Yet, the convergence of differential gene expression patterns between closely related species-pairs might reflect the role of natural selection during the process of ecological speciation. Here, we test for intercontinental convergence in differential transcriptional signatures between limnetic and benthic sympatric species-pairs of Lake Whitefish ( Coregonus clupeaformis ) and its sister-lineage, the European Whitefish ( C. lavaretus ), using six replicated sympatric species-pairs (two in North America, two in Norway and two in Switzerland). We characterized both sequence variation in transcribed regions and differential gene expression between sympatric limnetic and benthic species across regions and continents. Our first finding was that differentially expressed genes (DEG) between limnetic and benthic whitefish tend to be enriched in shared polymorphism among sister-lineages. We then used both genotypes and co-variation in expression in order to infer polygenic selection at the gene level. We identified parallel outliers and DEG involving genes primarily over-expressed in limnetic species relative to the benthic species. Our analysis finally revealed the existence of shared genomic bases underlying parallel differential expression across replicated species pairs from both continents, such as a cis -eQTL affecting the pyruvate kinase expression level involved in glycolysis. Our results are consistent with a longstanding role of natural selection in maintaining transcontinental diversity at phenotypic traits involved in ecological speciation between limnetic and benthic whitefishes.

Using massively parallel sequencing data from two species with different life history traits -- American lobster (Homarus americans) and Arctic Char (Salvelinus alpinus) -- we highlighted how an unbalanced sex ratio in the samples combined with a few sex-linked markers may lead to false interpretations of population structure and thus to potentially erroneous management recommendations. Multivariate analyses revealed two genetic clusters that separated males and females instead of showing the expected pattern of genetic differentiation among ecologically divergent (inshore vs. offshore in lobster) or geographically distant (east vs. west in Arctic Char) sampling locations. We created several subsamples artificially varying the sex ratio in the inshore/offshore and east/west groups, and then demonstrated that significant genetic differentiation could be observed despite panmixia for lobster, and that Fst values were overestimated for Arctic Char. This pattern was due to 12 and 94 sex-linked markers driving differentiation for lobster and Arctic Char, respectively. Removing sex-linked markers led to non- significant genetic structure (lobster) and a more accurate estimation of Fst (Arctic Char). We further characterized the putative functions of sex-linked markers. Given that only 9.6% of all marine/diadromous population genomic studies to date reported sex information, we urge researchers to collect and consider individual sex information. In summary, we argue that sex information is useful to (i) control sex ratio in sampling, (ii) overcome sex-ratio biases that can lead to spurious genetic differentiation signals and (iii) fill knowledge gaps regarding sex determining systems.