Background We recently described FastTree, a tool for inferring phylogenies for alignments with up to hundreds of thousands of sequences. Here, we describe improvements to FastTree that improve its accuracy without sacrificing scalability. Methodology/Principal Findings Where FastTree 1 used nearest-neighbor interchanges (NNIs) and the minimum-evolution criterion to improve the tree, FastTree 2 adds minimum-evolution subtree-pruning-regrafting (SPRs) and maximum-likelihood NNIs. FastTree 2 uses heuristics to restrict the search for better trees and estimates a rate of evolution for each site (the “CAT” approximation). Nevertheless, for both simulated and genuine alignments, FastTree 2 is slightly more accurate than a standard implementation of maximum-likelihood NNIs (PhyML 3 with default settings). Although FastTree 2 is not quite as accurate as methods that use maximum-likelihood SPRs, most of the splits that disagree are poorly supported, and for large alignments, FastTree 2 is 100–1,000 times faster. FastTree 2 inferred a topology and likelihood-based local support values for 237,882 distinct 16S ribosomal RNAs on a desktop computer in 22 hours and 5.8 gigabytes of memory. Conclusions/Significance FastTree 2 allows the inference of maximum-likelihood phylogenies for huge alignments. FastTree 2 is freely available at http://www.microbesonline.org/fasttree.

Gene families are growing rapidly, but standard methods for inferring phylogenies do not scale to alignments with over 10,000 sequences. We present FastTree, a method for constructing large phylogenies and for estimating their reliability. Instead of storing a distance matrix, FastTree stores sequence profiles of internal nodes in the tree. FastTree uses these profiles to implement Neighbor-Joining and uses heuristics to quickly identify candidate joins. FastTree then uses nearest neighbor interchanges to reduce the length of the tree. For an alignment with N sequences, L sites, and a different characters, a distance matrix requires O(N(2)) space and O(N(2)L) time, but FastTree requires just O(NLa + N ) memory and O(N log (N)La) time. To estimate the tree's reliability, FastTree uses local bootstrapping, which gives another 100-fold speedup over a distance matrix. For example, FastTree computed a tree and support values for 158,022 distinct 16S ribosomal RNAs in 17 h and 2.4 GB of memory. Just computing pairwise Jukes-Cantor distances and storing them, without inferring a tree or bootstrapping, would require 17 h and 50 GB of memory. In simulations, FastTree was slightly more accurate than Neighbor-Joining, BIONJ, or FastME; on genuine alignments, FastTree's topologies had higher likelihoods. FastTree is available at http://microbesonline.org/fasttree.

Targeted gene regulation on a genome-wide scale is a powerful strategy for interrogating, perturbing, and engineering cellular systems. Here, we develop a method for controlling gene expression based on Cas9, an RNA-guided DNA endonuclease from a type II CRISPR system. We show that a catalytically dead Cas9 lacking endonuclease activity, when coexpressed with a guide RNA, generates a DNA recognition complex that can specifically interfere with transcriptional elongation, RNA polymerase binding, or transcription factor binding. This system, which we call CRISPR interference (CRISPRi), can efficiently repress expression of targeted genes in Escherichia coli, with no detectable off-target effects. CRISPRi can be used to repress multiple target genes simultaneously, and its effects are reversible. We also show evidence that the system can be adapted for gene repression in mammalian cells. This RNA-guided DNA recognition platform provides a simple approach for selectively perturbing gene expression on a genome-wide scale.

Abstract Motivation: Molecular biotechnology now makes it possible to build elaborate systems models, but the systems biology community needs information standards if models are to be shared, evaluated and developed cooperatively. Results: We summarize the Systems Biology Markup Language (SBML) Level 1, a free, open, XML-based format for representing biochemical reaction networks. SBML is a software-independent language for describing models common to research in many areas of computational biology, including cell signaling pathways, metabolic pathways, gene regulation, and others. Availability: The specification of SBML Level 1 is freely available from http://www.sbml.org/ Contact: sysbio-team@caltech.edu * To whom correspondence should be addressed.

In cellular regulatory networks, genetic activity is controlled by molecular signals that determine when and how often a given gene is transcribed. In genetically controlled pathways, the protein product encoded by one gene often regulates expression of other genes. The time delay, after activation of the first promoter, to reach an effective level to control the next promoter depends on the rate of protein accumulation. We have analyzed the chemical reactions controlling transcript initiation and translation termination in a single such “genetically coupled” link as a precursor to modeling networks constructed from many such links. Simulation of the processes of gene expression shows that proteins are produced from an activated promoter in short bursts of variable numbers of proteins that occur at random time intervals. As a result, there can be large differences in the time between successive events in regulatory cascades across a cell population. In addition, the random pattern of expression of competitive effectors can produce probabilistic outcomes in switching mechanisms that select between alternative regulatory paths. The result can be a partitioning of the cell population into different phenotypes as the cells follow different paths. There are numerous unexplained examples of phenotypic variations in isogenic populations of both prokaryotic and eukaryotic cells that may be the result of these stochastic gene expression mechanisms.

Abstract Fluctuations in rates of gene expression can produce highly erratic time patterns of protein production in individual cells and wide diversity in instantaneous protein concentrations across cell populations. When two independently produced regulatory proteins acting at low cellular concentrations competitively control a switch point in a pathway, stochastic variations in their concentrations can produce probabilistic pathway selection, so that an initially homogeneous cell population partitions into distinct phenotypic subpopulations. Many pathogenic organisms, for example, use this mechanism to randomly switch surface features to evade host responses. This coupling between molecular-level fluctuations and macroscopic phenotype selection is analyzed using the phage λ lysis-lysogeny decision circuit as a model system. The fraction of infected cells selecting the lysogenic pathway at different phage:cell ratios, predicted using a molecular-level stochastic kinetic model of the genetic regulatory circuit, is consistent with experimental observations. The kinetic model of the decision circuit uses the stochastic formulation of chemical kinetics, stochastic mechanisms of gene expression, and a statistical-thermodynamic model of promoter regulation. Conventional deterministic kinetics cannot be used to predict statistics of regulatory systems that produce probabilistic outcomes. Rather, a stochastic kinetic analysis must be used to predict statistics of regulatory outcomes for such stochastically regulated systems.

To the Editor: Over the past two decades, the scale and complexity of genomics technologies and data have advanced from sequencing genomes of a few organisms to generating metagenomes, genome variation, gene expression, metabolites, and phenotype data for thousands of organisms and their communities.A major challenge in this data-rich age of biology is integrating heterogeneous and distributed data into predictive models of biological function, ranging from a single gene to entire organisms and their ecologies.The US Department of Energy (DOE) has invested substantially in efforts to understand the complex interplay between biological and abiotic processes that influence soil, water, and environmental dynamics of our biosphere.The community that has grown around these efforts recognizes the need for scientists of diverse backgrounds to have access to sophisticated computational tools that enable them to analyze complex and heterogeneous data sets and integrate their data and results effectively with the work of others.In this way, new data and conclusions can be rapidly propagated across existing, related analyses and easily discovered by the community for evaluation and comparison with previous results 1-3 .Here we present the DOE Systems Biology Knowledgebase (KBase, http://kbase.us),an open-source software and data platform that enables data sharing, integration, and analysis of microbes, plants, and their communities.KBase maintains an internal reference database that consolidates information from widely used external data repositories.This includes over 90,000 microbial genomes from RefSeq 4 , over 50 plant genomes from Phytozome 5 , over 300 Biolog media formulations 6 , and >30,000 reactions and compounds from KEGG 7 , BIGG 8 , and MetaCyc 9 .These public data are available for integration with user data where appropriate (e.g., genome comparison or building species trees).KBase links these diverse data types with a range of analytical functions within a web-based user interface.This extensive community resource facilitates large-scale analyses on scalable computing infrastructure and has

By using a bicistronic design, with a leader peptide that overlaps with and contains the Shine-Dalgarno site for a downstream gene of interest, the authors demonstrate reliable, context-independent gene expression. An inability to reliably predict quantitative behaviors for novel combinations of genetic elements limits the rational engineering of biological systems. We developed an expression cassette architecture for genetic elements controlling transcription and translation initiation in Escherichia coli: transcription elements encode a common mRNA start, and translation elements use an overlapping genetic motif found in many natural systems. We engineered libraries of constitutive and repressor-regulated promoters along with translation initiation elements following these definitions. We measured activity distributions for each library and selected elements that collectively resulted in expression across a 1,000-fold observed dynamic range. We studied all combinations of curated elements, demonstrating that arbitrary genes are reliably expressed to within twofold relative target expression windows with ∼93% reliability. We expect the genetic element definitions validated here can be collectively expanded to create collections of public-domain standard biological parts that support reliable forward engineering of gene expression at genome scales.

Significance The study of ecological succession remains at the core of ecology. Understanding the trajectories and mechanisms controlling ecological succession is crucial to predicting the responses of ecosystems to environmental change and projecting their future states. By definition, deterministic succession is expected under homogeneous abiotic and biotic starting conditions. This study, however, shows that the succession of groundwater microbial communities in response to nutrient amendment is primarily stochastic, but that the drivers controlling biodiversity and succession are dynamic rather than static. By identifying the mechanisms controlling microbial community assembly and succession, this study makes fundamental contribution to the mechanistic understanding essential for a predictive microbial ecology of many systems ranging from microbiomes of humans and plants to natural and managed ecosystems.