We report a three-dimensional microscopy technique—swept, confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy—that allows volumetric imaging of living samples at ultrahigh speeds. Although confocal and two-photon microscopy have revolutionized biomedical research, current implementations are costly, complex and limited in their ability to image three-dimensional volumes at high speeds. Light-sheet microscopy techniques using two-objective, orthogonal illumination and detection require a highly constrained sample geometry and either physical sample translation or complex synchronization of illumination and detection planes. In contrast, SCAPE microscopy acquires images using an angled, swept light sheet in a single-objective, en face geometry. Unique confocal descanning and image rotation optics map this moving plane onto a stationary high-speed camera, permitting completely translationless three-dimensional imaging of intact samples at rates exceeding 20 volumes per second. We demonstrate SCAPE microscopy by imaging spontaneous neuronal firing in the intact brain of awake behaving mice, as well as freely moving transgenic Drosophila larvae. A swept light-sheet microscopy scheme allows volumetric imaging of living samples at high speed.

Synaptic transmission initiates a cascade of signal transduction events that couple neuronal activity to local changes in blood flow and oxygenation. Although a number of vasoactive molecules and specific cell types have been implicated, the transformation of stimulus-induced activation of neuronal circuits to hemodynamic changes is still unclear. We use somatosensory stimulation and a suite of in vivo imaging tools to study neurovascular coupling in rat primary somatosensory cortex. Our stimulus evoked a central region of net neuronal depolarization surrounded by net hyperpolarization. Hemodynamic measurements revealed that predominant depolarization corresponded to an increase in oxygenation, whereas predominant hyperpolarization corresponded to a decrease in oxygenation. On the microscopic level of single surface arterioles, the response was composed of a combination of dilatory and constrictive phases. Critically, the relative strength of vasoconstriction covaried with the relative strength of oxygenation decrease and neuronal hyperpolarization. These results suggest that a neuronal inhibition and concurrent arteriolar vasoconstriction correspond to a decrease in blood oxygenation, which would be consistent with a negative blood oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging signal.

Significance Resting-state functional connectivity mapping exploits correlations in the functional magnetic resonance imaging (fMRI) blood oxygen level-dependent (BOLD) signal across the brain. However, results are difficult to interpret without an understanding of the neural correlates of these hemodynamic fluctuations. This work uses mice in which neural activity and brain hemodynamics can be mapped simultaneously. We show that resting-state hemodynamics can be predicted from spontaneous neural activity and correspond to a series of driven increases in local blood volume, coupled with spontaneous, bilaterally symmetric fluctuations in excitatory neural activity. This result provides reassurance that resting-state functional connectivity has neural origins. The network-like spontaneous neural activity visualized here represents an underexplored feature of neural activity in the awake brain.

The functional modulation of blood flow in the brain is critical for brain health and is the basis of contrast in functional magnetic resonance imaging. There is evident coupling between increases in neuronal activity and increases in local blood flow; however, many aspects of this neurovascular coupling remain unexplained by current models. Based on the rapid dilation of distant pial arteries during cortical functional hyperemia, we hypothesized that endothelial signaling may play a key role in the long-range propagation of vasodilation during functional hyperemia in the brain. Although well characterized in the peripheral vasculature, endothelial involvement in functional neurovascular coupling has not been demonstrated.We combined in vivo exposed-cortex multispectral optical intrinsic signal imaging (MS-OISI) with a novel in vivo implementation of the light-dye technique to record the cortical hemodynamic response to somatosensory stimulus in rats before and after spatially selective endothelial disruption. We demonstrate that discrete interruption of endothelial signaling halts propagation of stimulus-evoked vasodilation in pial arteries, and that wide-field endothelial disruption in pial arteries significantly attenuates the hemodynamic response to stimulus, particularly the early, rapid increase and peak in hyperemia.Involvement of endothelial pathways in functional neurovascular coupling provides new explanations for the spatial and temporal features of the hemodynamic response to stimulus and could explain previous results that were interpreted as evidence for astrocyte-mediated control of functional hyperemia. Our results unify many aspects of blood flow regulation in the brain and body and prompt new investigation of direct links between systemic cardiovascular disease and neural deficits.

The cortical hemodynamic response to somatosensory stimulus is investigated at the level of individual vascular compartments using both depth-resolved optical imaging and in-vivo two-photon microscopy. We utilize a new imaging and spatiotemporal analysis approach that exploits the different characteristic dynamics of responding arteries, arterioles, capillaries and veins to isolate their three-dimensional spatial extent within the cortex. This spatial delineation is validated using vascular casts. Temporal delineation is supported by in-vivo two-photon microscopy of the temporal dynamics and vascular mechanisms of the arteriolar and venous responses. Using these techniques we have been able to characterize the roles of the different vascular compartments in generating and controlling the hemodynamic response to somatosensory stimulus. We find that changes in arteriolar total hemoglobin concentration agree well with arteriolar dilation dynamics, which in turn correspond closely with changes in venous blood flow. For 4-s stimuli, we see only small changes in venous hemoglobin concentration, and do not detect measurable dilation or ballooning in the veins. Instead, we see significant evidence of capillary hyperemia. We compare our findings to historical observations of the composite hemodynamic response from other modalities including functional magnetic resonance imaging. Implications of our results are discussed with respect to mathematical models of cortical hemodynamics, and to current theories on the mechanisms underlying neurovascular coupling. We also conclude that our spatiotemporal analysis approach is capable of isolating and localizing signals from the capillary bed local to neuronal activation, and holds promise for improving the specificity of other hemodynamic imaging modalities.

Changes in neuronal activity are accompanied by the release of vasoactive mediators that cause microscopic dilation and constriction of the cerebral microvasculature and are manifested in macroscopic blood oxygenation level-dependent (BOLD) functional MRI (fMRI) signals. We used two-photon microscopy to measure the diameters of single arterioles and capillaries at different depths within the rat primary somatosensory cortex. These measurements were compared with cortical depth-resolved fMRI signal changes. Our microscopic results demonstrate a spatial gradient of dilation onset and peak times consistent with “upstream” propagation of vasodilation toward the cortical surface along the diving arterioles and “downstream” propagation into local capillary beds. The observed BOLD response exhibited the fastest onset in deep layers, and the “initial dip” was most pronounced in layer I. The present results indicate that both the onset of the BOLD response and the initial dip depend on cortical depth and can be explained, at least in part, by the spatial gradient of delays in microvascular dilation, the fastest response being in the deep layers and the most delayed response in the capillary bed of layer I.

What are the spatial and temporal scales of brainwide neuronal activity, and how do activities at different scales interact? We used SCAPE microscopy to image a large fraction of the central brain of adult Drosophila melanogaster with high spatiotemporal resolution while flies engaged in a variety of behaviors, including running, grooming and flailing. This revealed neural representations of behavior on multiple spatial and temporal scales. The activity of most neurons across the brain correlated (or, in some cases, anticorrelated) with running and flailing over timescales that ranged from seconds to almost a minute. Grooming elicited a much weaker global response. Although these behaviors accounted for a large fraction of neural activity, residual activity not directly correlated with behavior was high dimensional. Many dimensions of the residual activity reflect the activity of small clusters of spatially organized neurons that may correspond to genetically defined cell types. These clusters participate in the global dynamics, indicating that neural activity reflects a combination of local and broadly distributed components. This suggests that microcircuits with highly specified functions are provided with knowledge of the larger context in which they operate, conferring a useful balance of specificity and flexibility.

SUMMARY Learning alters cortical representations and improves perception. Apical tuft dendrites in Layer 1, which are unique in their connectivity and biophysical properties, may be a key site of learning-induced plasticity. We used both two-photon and SCAPE microscopy to longitudinally track tuft-wide calcium spikes in apical dendrites of Layer 5 pyramidal neurons as mice learned a tactile behavior. Mice were trained to discriminate two orthogonal directions of whisker stimulation. Reinforcement learning, but not repeated stimulus exposure, enhanced tuft selectivity for both directions equally, even though only one was associated with reward. Selective tufts emerged from initially unresponsive or low-selectivity populations. Animal movement and choice did not account for changes in stimulus selectivity. Enhanced selectivity persisted even after rewards were removed and animals ceased performing the task. We conclude that learning produces long-lasting realignment of apical dendrite tuft responses to behaviorally relevant dimensions of a task.

Abstract When threatened by dangerous or harmful stimuli, animals engage in diverse forms of rapid escape behaviors. In Drosophila larvae, one type of escape response involves C-shaped bending and lateral rolling followed by rapid forward crawling. The sensory circuitry that promotes larval escape has been extensively characterized; however, the motor programs underlying rolling are unknown. Here, we characterize the neuromuscular basis of rolling escape behavior. We used high-speed, volumetric, Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (SCAPE) microscopy to image muscle activity during larval rolling. Unlike sequential peristaltic muscle contractions that progress from segment to segment during forward and backward crawling, the muscle activity progresses circumferentially during bending and rolling escape behavior. We propose that progression of muscular contraction around the larva’s circumference results in a transient misalignment between weight and the ground support forces, which generates a torque that induces stabilizing body rotation. Therefore, successive cycles of slight misalignment followed by reactive aligning rotation lead to continuous rolling motion. Supporting our biomechanical model, we found that disrupting the activity of muscle groups undergoing circumferential contraction progression lead to rolling defects. We use EM connectome data to identify premotor to motor connectivity patterns that could drive rolling behavior, and perform neural silencing approaches to demonstrate the crucial role of a group of glutamatergic premotor neurons in rolling. Our data reveal body-wide muscle activity patterns and putative premotor circuit organization for execution of the rolling escape response. Significance Statement To escape from dangerous stimuli, animals execute escape behaviors that are fundamentally different from normal locomotion. The rolling escape behavior of Drosophila larvae consists of C-shaped bending and rolling. However, the muscle contraction patterns that lead to rolling are poorly understood. We find that following the initial body bending, muscles contract in a circumferential wave around the larva as they enter the bend, maintaining unidirectional rolling that resembles cylinder rolling on a surface. We study the structure of motor circuits for rolling, inhibit different motor neurons to determine which muscles are essential for rolling, and propose circuit and biomechanical models for roll generation. Our findings provide insights into how motor circuits produce diverse motor behaviors.