ARM-seq enables enhanced sequencing of modified tRNAs and tRNA fragments. Treatment of RNA with the demethylase AlkB prior to reverse transcription removes three ‘hard-stop’ modifications, allowing for discovery of modified tRNA fragments and their precursors by RNA sequencing. High-throughput RNA sequencing has accelerated discovery of the complex regulatory roles of small RNAs, but RNAs containing modified nucleosides may escape detection when those modifications interfere with reverse transcription during RNA-seq library preparation. Here we describe AlkB-facilitated RNA methylation sequencing (ARM-seq), which uses pretreatment with Escherichia coli AlkB to demethylate N1-methyladenosine (m1A), N3-methylcytidine (m3C) and N1-methylguanosine (m1G), all commonly found in tRNAs. Comparative methylation analysis using ARM-seq provides the first detailed, transcriptome-scale map of these modifications and reveals an abundance of previously undetected, methylated small RNAs derived from tRNAs. ARM-seq demonstrates that tRNA fragments accurately recapitulate the m1A modification state for well-characterized yeast tRNAs and generates new predictions for a large number of human tRNAs, including tRNA precursors and mitochondrial tRNAs. Thus, ARM-seq provides broad utility for identifying previously overlooked methyl-modified RNAs, can efficiently monitor methylation state and may reveal new roles for tRNA fragments as biomarkers or signaling molecules.

Abstract While splicing changes caused by somatic mutations in SF3B1 are known, identifying full-length isoform changes may better elucidate the functional consequences of these mutations. We report nanopore sequencing of full-length cDNA from CLL samples with and without SF3B1 mutation, as well as normal B cell samples, giving a total of 149 million pass reads. We present FLAIR (Full-Length Alternative Isoform analysis of RNA), a computational workflow to identify high-confidence transcripts, perform differential splicing event analysis, and differential isoform analysis. Using nanopore reads, we demonstrate differential 3’ splice site changes associated with SF3B1 mutation, agreeing with previous studies. We also observe a strong downregulation of intron retention events associated with SF3B1 mutation. Full-length transcript analysis links multiple alternative splicing events together and allows for better estimates of the abundance of productive versus unproductive isoforms. Our work demonstrates the potential utility of nanopore sequencing for cancer and splicing research.

RNA-Seq has brought forth significant discoveries regarding aberrations in RNA processing, implicating these RNA variants in a variety of diseases. Aberrant splicing and single nucleotide variants in RNA have been demonstrated to alter transcript stability, localization, and function. In particular, the upregulation of ADAR, an enzyme which mediates adenosine-to-inosine editing, has been previously linked to an increase in the invasiveness of lung ADC cells and associated with splicing regulation. Despite the functional importance of studying splicing and SNVs, short read RNA-Seq has limited the community's ability to interrogate both forms of RNA variation simultaneously.We employed long-read technology to obtain full-length transcript sequences, elucidating cis-effects of variants on splicing changes at a single molecule level. We have developed a computational workflow that augments FLAIR, a tool that calls isoform models expressed in long-read data, to integrate RNA variant calls with the associated isoforms that bear them. We generated nanopore data with high sequence accuracy of H1975 lung adenocarcinoma cells with and without knockdown of ADAR. We applied our workflow to identify key inosine-isoform associations to help clarify the prominence of ADAR in tumorigenesis.Ultimately, we find that a long-read approach provides valuable insight toward characterizing the relationship between RNA variants and splicing patterns.

SF3B1 is one of the most frequently mutated genes in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and is associated with poor patient prognosis. While alternative splicing patterns caused by mutations in SF3B1 have been identified with short-read RNA sequencing, a critical barrier in understanding the functional consequences of these splicing changes is that we lack the full transcript context in which these changes are occurring. Using nanopore sequencing technology, we have resequenced full-length cDNA from CLL samples with and without the hotspot SF3B1 K700E mutation, and a normal B cell. We have developed a workflow called FLAIR (Full-Length Alternative Isoform analysis of RNA), leveraging the full-length transcript sequencing data that nanopore affords. We report results from nanopore sequencing that are concordant with known SF3B1 biology from short read sequencing as well as altered intron retention events more confidently observed using long reads. Splicing analysis of nanopore reads between the SF3B1WT and SF3B1K700E samples identifies alternative upstream 3' splice sites associated with SF3B1K700E. We also find downregulation of intron retention events in SF3B1K700E relative to SF3B1WT and no difference between CLL SF3B1MUT and B cell, suggesting an aberrant intron retention landscape in CLL samples lacking SF3B1 mutation. With full-length isoforms, we are able to better estimate the abundance of RNA transcripts that are productive and will likely be translated versus those that are unproductive. Validation from short-read data also reveals a strong branch point sequence in these downregulated intron retention events, consistent with previously reported branch points associated with mutated SF3B1. As nanopore sequencing has yet to become a routine tool for characterization of the transcriptome, our work demonstrates the potential utility of nanopore sequencing for cancer and splicing research.

ABSTRACT Genome-wide identification of chromatin organization and structure has been generally probed by measuring accessibility of the underlying DNA to nucleases or methyltransferases. These methods either only observe the positioning of a single nucleosome or rely on large enzymes to modify or cleave the DNA. We developed adduct sequencing (Add-seq), a method to probe chromatin accessibility by treating chromatin with the small molecule angelicin, which preferentially intercalates into DNA not bound to core nucleosomes. We show that Nanopore sequencing of the angelicin-modified DNA is possible and allows visualization and analysis of long single molecules with distinct chromatin structure. The angelicin modification can be detected from the Nanopore current signal data using a neural network model trained on unmodified and modified chromatin-free DNA. Applying Add-seq to Saccharomyces cerevisiae nuclei, we identified expected patterns of accessibility around annotated gene loci in yeast. We also identify individual clusters of single molecule reads displaying different chromatin structure at specific yeast loci, which demonstrates heterogeneity in the chromatin structure of the yeast population. Thus, using Add-seq, we are able to profile DNA accessibility in the yeast genome across long molecules. GRAPHICAL ABSTRACT

Abstract Dynamics and non-genetic heterogeneity are two fundamental characteristics of basic processes of life such as cell division or differentiation. Time-lapse microscopy is the only method that can directly capture the dynamics and heterogeneity of fundamental cellular processes at the singlecell level with high temporal resolution. Successful application of single-cell time-lapse microscopy requires automated segmentation and tracking of hundreds of individual cells over several time points. Recently, deep learning models have ushered in a new era in the quantitative analysis of microscopy images. However, integrated segmentation and tracking of single cells remain challenges for the analysis of time-lapse microscopy images. This work presents a versatile and trainable deep-learning software, termed DeepSea, that allows for both segmentation and tracking of single cells in sequences of phase-contrast live microscopy images. Our segmentation model can easily be trained to segment phase-contrast images of different cell types with higher precision than existing models. Our tracking model allows for quantification of dynamics of several cell biological features of individual cells, such as cell division cycle, mitosis, cell morphology, and cell size, with high precision using phase-contrast images. We showcase the application of DeepSea by analyzing cell size regulation in embryonic stem cells. Our findings show that embryonic stem cells exhibit cell size control in the G1 phase of the cell cycle despite their unusual fast division cycle. Our training dataset, user-friendly software, and code are available here https://deepseas.org .

U2AF1 S34F is one of the most recurrent splicing factor mutations in lung adenocarcinoma (ADC) and has been shown to cause transcriptome-wide pre-mRNA splicing alterations. While U2AF1 S34F -associated splicing alterations have been described, the function of altered mRNA isoform changes remains largely unexplored. To better understand the impact U2AF1 S34F has on isoform fate and function, we conducted high-throughput long-read cDNA sequencing from isogenic human bronchial epithelial cells with and without U2AF1 S34F mutation. We found that nearly 75% (49,366) of our long-read constructed multiexon isoforms do not overlap GENCODE or short-read assembled isoforms. We found 198 transcript isoforms with significant expression and usage changes caused by U2AF1 S34F mutation, including a novel lncRNA. Isoforms from immune-related genes were largely downregulated in mutant cells, none of which were found to have splicing changes. Finally, isoforms likely targeted by nonsense-mediated decay were preferentially downregulated in U2AF1 S34F cells, suggesting that the impact of observed isoform changes may alter the translational output of affected genes. Altogether, long-read sequencing provided additional insights into transcriptome alterations and downstream functional consequences associated with U2AF1 S34F mutation.

Structural models of multi-megadalton molecular complexes are appearing in increasing numbers, in large part because of technical advances in cryo-electron microscopy realized over the last decade. However, the inherent complexity of large biological assemblies comprising dozens of components often limits the resolution of structural models. Furthermore, multiple functional configurations of a complex can leave a puzzle as to how one intermediate moves to the next stage. Orthogonal biochemical information is crucial to understanding the molecular interactions that drive those rearrangements. We present a two-step method for chemical probing detected by tandem mass-spectrometry to globally assess the reactivity of lysine residues within purified macromolecular complexes. Because lysine side chains often balance the negative charge of RNA in ribonucleoprotein complexes, the method is especially powerful for detecting changes in protein-RNA interactions. Probing the E. coli 30S ribosome subunit showed that the reactivity pattern of lysine residues quantitatively reflects structure models from X-ray crystallography. We assessed differences in two conformations of purified human spliceosomes. Our results demonstrate that this method supplies powerful biochemical information that aids in functional interpretation of atomic models of macromolecular complexes at the intermediate resolution often provided by cryo-electron microscopy.