Abstract Deciphering the neural code underlying goal-directed behavior is a long-term mission in neuroscience 1,2 . Neurons exhibiting preparation and movement-related activity are intermingled in the premotor and motor cortices 3,4 , thus concealing the neural code of planned movements. We employed a combination of electrophysiology, pathway-specific optogenetics, phototagging, and inverse reinforcement learning (RL) to elucidate the role of defined neuronal subpopulations in the rat rostral and caudal forelimb areas (RFA and CFA), which correspond to the premotor and motor cortical areas. The inverse RL enabled the functional dissection of spatially intermingled neuronal subpopulations, complementing our pathway-specific optogenetic manipulations and unveiling differential functions of the preparation and movement subpopulations projecting from RFA to CFA. Our results show that the projecting preparation subpopulation suppresses movements, whereas the projecting movement subpopulation promotes actions. We found the influence of RFA on CFA to be adaptable, with the projection either inhibiting or exciting neurons in the superficial and deep CFA layers, depending on context and task phase. These complex interactions between RFA and CFA likely involve the differential recruitment of inhibitory interneurons in the CFA, which is supported by our electron microscopy analysis of the connectivity between these regions. We provide here unprecedented mechanistic insights into how the premotor and primary motor cortices are functionally and structurally interlinked with the potential to advance neuroprosthetics. Graphical abstract This study provides mechanistic insights into the interactions between the rostral forelimb area (RFA) and the caudal forelimb area (CFA). Specifically, we provide evidence for a differential impact of RFA on CFA depending on the task phase and the targeted CFA layers. RFA contains at least two spatially intermingled subpopulations - one related to movement preparation and one to movement execution. Both subpopulations project to CFA. Here we investigated the impact of these two subpopulations on the activity of the local CFA circuit as well as on the behavior in different contexts. When rats were not involved in a task, the effect of RFA was mainly excitatory in the deep CFA layers, while the superficial layers remained unaffected. This can be interpreted as a non-selective activation of the deep CFA neurons enabling a variety of spontaneous movements. During the preparation phase before a movement, the RFA had an opposite impact on the superficial and deep layers: while the superficial CFA layers were excited by RFA input, the deeper layers were mostly inhibited, minimizing movements and enabling continued holding of a lever. During the movement phase, the inhibitory effect on neurons in the deep CFA layers was counterbalanced by excitation, thus enabling a selected conduction of movements. The opposing effects during preparation and movement phase on CFA deep layers were correlated with increased firing rates of the RFA preparation and movement subpopulations, respectively, making it likely that the inhibition resulted from increased activities of these subpopulation specifically. With an electron microcopy approach we demonstrate that inhibitory and excitatory CFA neurons are directly targeted by RFA, thus providing a mechanism for the bidirectional control of CFA activity. Please note that the depicted impact of RFA on excitatory or inhibitory CFA neurons refers to net effects in this figure, not to the targeting of individual neurons.

Abstract The impact of spontaneous movements on neuronal activity has created the need to quantify behavior. We present a versatile framework to directly capture the 3D motion of freely definable body points in a marker-free manner with high precision and reliability. Combining the tracking with neural recordings revealed multiplexing of information in the motor cortex neurons of freely moving rats. By integrating multiple behavioral variables into a model of the neural response, we derived a virtual head-fixation for which the influence of specific body movements was removed. This strategy enabled us to analyze the behavior of interest (e.g., front paw movements). Thus, we unveiled an unexpectedly large fraction of neurons in the motor cortex with tuning to the paw movements, which was previously masked by body posture tuning. Once established, our framework can be efficiently applied to large datasets while minimizing the experimental workload caused by animal training and manual labeling.

The smooth conduction of movements requires simultaneous motor planning and execution according to internal goals. So far it is not known how such movement plans can be modified without being distorted by ongoing movements. Previous studies have isolated planning and execution related neuronal activity by separating behavioral planning and movement periods in time by sensory cues. Here, we introduced two novel tasks in which motor planning developed intrinsically. We separated this continuous self-paced motor planning statistically from motor execution by experimentally minimizing the repetitiveness of the movements. Thereby, we found that in the rat sensorimotor cortex, neuronal motor planning processes evolved with slower dynamics than movement related responses both on a sorted unit and population level. The fast evolving neuronal activity preceded skilled forelimb movements while it coincided with movements in a locomotor task. We captured this fast evolving movement related activity via a high-pass filter approach. As biological mechanism underlying such a high pass filtering we suggest neuronal adaption. The differences in dynamics combined with a high pass filtering mechanism represents a simple principle for concurrent motor planning and execution in which planning will result in relatively slow dynamics that will not produce movements.

Our knowledge about neuronal activity in the sensorimotor cortex relies primarily on stereotyped movements that are strictly controlled in experimental settings. It remains unclear how results can be carried over to less constrained behavior like that of freely moving subjects. Toward this goal, we developed a self-paced behavioral paradigm that encouraged rats to engage in different movement types. We employed bilateral electrophysiological recordings across the entire sensorimotor cortex and simultaneous paw tracking. These techniques revealed behavioral coupling of neurons with lateralization and an anterior--posterior gradient from the premotor to the primary sensory cortex. The structure of population activity patterns was conserved across animals despite the severe under-sampling of the total number of neurons and variations in electrode positions across individuals. We demonstrated cross-subject and cross-session generalization in a decoding task through alignments of low-dimensional neural manifolds, providing evidence of a conserved neuronal code.

Abstract To survive in a complex and changing environment, animals must adapt their behavior. This ability is called behavioral flexibility and is classically evaluated by a reversal learning paradigm. During such a paradigm, the animals adapt their behavior according to a change of the reward contingencies. To study these complex cognitive functions (from outcome evaluation to motor adaptation), we developed a versatile, low-cost, open-source platform, allowing us to investigate the neuronal correlates of behavioral flexibility with 1-photon calcium imaging. This platform consists of FreiBox, a novel low-cost Arduino behavioral setup, as well as further open-source tools which we developed and integrated into our framework. FreiBox is controlled by a custom Python interface and integrates a new licking sensor (Strain Gauge lickometer) for controlling spatial licking behavioral tasks. In addition to allowing both discriminative and serial reversal learning, the Arduino can track mouse licking behavior in real time to control task events in a sub-millisecond timescale. To complete our setup, we also developed and validated an affordable commutator, crucial for recording calcium imaging with the Miniscope V4 in freely moving mice. Further, we demonstrated that FreiBox can be associated with 1-photon imaging and other open-source initiatives (e.g., Open Ephys), to form a versatile platform for exploring the neuronal substrates of licking based behavioral flexibility in mice. The combination of the FreiBox behavioral setup and our low-cost commutator represents a highly competitive and complementary addition to the recently emerging battery of open-source initiatives. Significance Statement Behavioral flexibility is essential to survive in a complex and changing environment. To study this cognitive ability in freely-moving mice, we developed a versatile, low-cost, open-source behavioral setup, called FreiBox, allowing us to investigate the neuronal correlates of licking-based behavioral flexibility. FreiBox is controlled by a custom Python interface and integrates a new licking sensor for controlling spatial licking behavioral tasks (e.g. discriminative learning, reversal learning). We also developed and validated an active commutator to record calcium imaging with the Miniscope V4 in freely moving mice. Finally, we demonstrated that FreiBox can be associated with 1-photon imaging and other open-source initiatives, to form a versatile platform for exploring the neuronal substrates of licking based behavioral flexibility in mice.

Neural oscillations as important information carrier in the brain, are increasingly interpreted as transient bursts rather than as sustained oscillations. Short (<150 ms) bursts of beta-waves (15-30 Hz) have been documented in humans, monkeys, and mice. These events were correlated with memory, movement and perception, and were even suggested as the primary ingredient of all beta-band activity. However, a method to measure these short-lived events in real-time and to investigate their causal impact on behaviour and overall oscillatory power is missing. Here we present a real-time data analysis system, capable to detect short and narrowband bursts. The system is associated with an operant conditioning apparatus for rodents, thus enabling closing the loop between oscillatory events and behaviour (neurofeedback). We successfully trained 3 rats to increase the beta event rate in motor cortex, and indeed observed an overall increase in beta-power, supporting the critical role of events on beta-band activity. The increase in beta could be linked to behaviour, as a machine learning algorithm could reliably predict occurrences of beta events based on the rats' movements. Our results demonstrate the potency and flexibility of the real-time neurofeedback system in a freely moving rodent as well as the impact of transient bursts on global oscillatory power. Our approach can be a starting point for a plethora of studies targeted at understanding the causal role of oscillatory bursts. For example, instead of artificial external stimuli, real-time burst-triggered stimulus presentations could be combined with behavioural and electrophysiological measurements, thereby allowing to probe the intrinsic function of oscillatory bursts. Furthermore, neurofeedback has been clinically used for decades without a clear understanding of the underlying neural mechanisms. As our tool is ideally suited for rodents, it can be combined with additional invasive or non-invasive treatments and post-mortem histology, thereby providing a new testbed with high relevance for future clinical developments.

Abstract Bradykinin increases skin blood flow via a cGMP mechanism but its role in sweating in vivo is unclear. There is a current need to translate cell culture and non-human paw pad studies into in vivo human preparations to test for therapeutic viability for disorders affecting sweat glands. Protocol 1: physiological sweating was induced in 10 healthy subjects via perfusing warm (46-48°C) water through a tube-lined suit while bradykinin type 2 receptor (B2R) antagonist (HOE-140; 40 μM) and only the vehicle (lactated Ringer’s) were perfused intradermally via microdialysis. Heat stress increased sweat rate (HOE-140 = +0.79±0.12 and vehicle = +0.64±0.10 mg/cm 2 /min), but no differences were noted with B2R antagonism. Protocol 2: pharmacological sweating was induced in 6 healthy subjects via intradermally perfusing pilocarpine (1.67 mg/ml) followed by the same B2R antagonist approach. Pilocarpine increased sweating (HOE-140 = +0.38±0.16 and vehicle = +0.32±0.12 mg/cm 2 /min); again no differences were observed with B2R antagonism. Lastly, 5 additional subjects were recruited for various control experiments which identified that a functional dose of HOE-140 was utilized and it was not sudorific during normothermic conditions. These data indicate B2R antagonists do not modulate physiologically-or pharmacologically-induced eccrine secretion volumes. Thus, B2R agonist/antagonist development as a potential therapeutic target for hypo- and hyperhidrosis appears unwarranted.

Abstract Objective Optogenetics involves delivery of light-sensitive opsins to the target brain region, as well as introduction of optical and electrical devices to manipulate and record neural activity, respectively, from the targeted neural population. Combining these functionalities in a single implantable device is of great importance for a precise investigation of neural networks while minimizing tissue damage. Approach We report on the development, characterization, and in vivo validation of a multifunctional optrode that combines a silicon-based neural probe with an integrated microfluidic channel, and an optical glass fiber in a compact assembly. The silicon probe comprises an 11-μm-wide fluidic channel and 32 recording electrodes (diameter 30 μm) on a tapered probe shank with a length, thickness, and maximum width of 7.5 mm, 50 μm, and 150 μm, respectively. The size and position of fluidic channels, electrodes, and optical fiber can be precisely tuned according to the in vivo application. Main results With a total system weight of 0.97 g, our multifunctional optrode is suitable for chronic in vivo experiments requiring simultaneous drug delivery, optical stimulation, and neural recording. We demonstrate the utility of our device in optogenetics by injecting a viral vector carrying a ChR2-construct in the prefrontal cortex and subsequent photostimulation of the transfected neurons while recording neural activity from both the target and adjacent regions in a freely moving rat. Additionally, we demonstrate a pharmacological application of our device by injecting GABA antagonist bicuculline in an anesthetized rat brain and simultaneously recording the electrophysiological response. Significance Our triple-modality device enables a single-step optogenetic surgery. In comparison to conventional multi-step surgeries, our approach achieves higher spatial specificity while minimizing tissue damage. Graphical abstract

The increasing awareness of the impact of spontaneous movements on neuronal activity has raised the need to track behavior. We present FreiPose, a versatile learning-based framework to directly capture 3D motion of freely definable points with high precision (median error < 3.5% body length, 41.9% improvement compared to state-of-the-art) and high reliability (82.8% keypoints within < 5% body length error boundary, 72.0% improvement). The versatility of FreiPose is demonstrated in two experiments: (1) By tracking freely moving rats with simultaneous electrophysiological recordings in motor cortex, we identified neuronal tuning to behavioral states and individual paw trajectories. (2)We inferred time points of optogenetic stimulation in rat motor cortex from the measured pose across individuals and attributed the stimulation effect automatically to body parts. The versatility and accuracy of FreiPose open up new possibilities for quantifying behavior of freely moving animals and may lead to new ways of setting up experiments.

Summary Simultaneous large-scale recordings and optogenetic interventions hold the promise to decipher the fast-paced and multifaceted dialogue between neurons that sustains brain function. Here we developed unprecedentedly thin, cell-sized Lambertian side-emitting optical fibers and combined them with silicon probes to achieve high quality recordings and ultrafast multichannel optogenetic inhibition in freely moving animals. Our new framework paves the way for large-scale photo tagging and controlled interrogation of rapid neuronal communication in any combination of brain areas. Highlights To combine large-scale recordings with optical perturbation we have developed a number of new techniques such as thin optical side-emitting fibers, a fiber matrix connector for thin fibers, an electro-optical commutator for multiple thin fibers, an active patch cord, a flexible fiber bundle ribbon cable, and a modular multi-optrode implantation holder.