Abstract Germ cells are the vehicle of human reproduction, arising early in embryonic development and developing throughout adult life until menopause onset in women. Primordial germ cells are the common precursors of germline cells in both sexes, undergoing sexual specification into oogonia or gonocytes which further develop into oocytes or spermatocytes during development. Methods for recapitulation of primordial germ cell and oogonia formation have been developed extensively in recent decades, but fundamental technical limitations in their methodologies, throughput, and yield limit their utilization. Recently, transcription factor (TF)-based methods for human primordial germ cell-like cell (hPGCLC) formation, mouse meiotic entry, and mouse oocyte maturation have demonstrated the feasibility of gene overexpression screening in identifying potent regulators of germ cell development. Here we screened 47 folliculogenesis-regulating TFs for their role in hPGCLC and oogonia formation, identifying DLX5, HHEX , and FIGLA whose individual overexpression enhances hPGCLC formation from hiPSCs. Additionally, we identify a set of three TFs, ZNF281, LHX8 , and SOHLH1 , whose combinatorial overexpression drives direct oogonia-like formation from hiPSCs in a four-day, feeder-free monolayer culture condition with additional feeder-free culture capabilities post-isolation. We characterize these TF-based germ cells via gene and protein expression analyses, and demonstrate their broad similarity to in vivo germ cells. Together, these results identify novel regulators of human germ cell development and establish new TF-based tools for human in vitro oogenesis research.

A bstract The creation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) has enabled scientists to explore the derivation of many types of cells. While there are diverse general approaches for cell-fate engineering, one of the fastest and most efficient approaches is transcription factor (TF) over-expression. However, finding the right combination of TFs to over-express to differentiate iPSCs directly into other cell-types is a difficult task. Here were describe a machine-learning (ML) pipeline, called CellCartographer , for using chromatin accessibility data to design multiplex TF pooled-screens for cell type conversions. We validate this method by differentiating iPSCs into twelve diverse cell types at low efficiency in preliminary screens and then iteratively refining our TF combinations to achieve high efficiency differentiation for six of these cell types in < 6 days. Finally, we functionally characterized engineered iPSC-derived cytotoxic T-cells (iCytoT), regulatory T-cells (iTReg), type II astrocytes (iAstII), and hepatocytes (iHep) to validate functionally accurate differentiation.

Abstract Large-scale recoding has been shown to enable novel amino acids, biocontainment and viral resistance in bacteria only so far. Here we extend this to human cells demonstrating exceptional base editing to convert TAG to TAA for 33 essential genes via a single transfection, and examine base-editing genome-wide (observing ~ 40 C-to-T off-target events in essential gene exons). We also introduce GRIT, a computational tool for recoding. This demonstrates the feasibility of recoding, and multiplex editing in mammalian cells.

Abstract: Methods for highly multiplexed RNA imaging are limited in spatial resolution, and thus in their ability to localize transcripts to nanoscale and subcellular compartments. We adapt expansion microscopy, which physically expands biological specimens, for long-read untargeted and targeted in situ RNA sequencing. We applied untargeted expansion sequencing (ExSeq) to mouse brain, yielding readout of thousands of genes, including splice variants and novel transcripts. Targeted ExSeq yielded nanoscale-resolution maps of RNAs throughout dendrites and spines in neurons of the mouse hippocampus, revealing patterns across multiple cell types; layer-specific cell types across mouse visual cortex; and the organization and position-dependent states of tumor and immune cells in a human metastatic breast cancer biopsy. Thus ExSeq enables highly multiplexed mapping of RNAs, from nanoscale to system scale. One Sentence Summary In situ sequencing of physically expanded specimens enables multiplexed mapping of RNAs at nanoscale, subcellular resolution.

Abstract The ability to differentiate stem cells into human cell types is essential to define basic mechanisms and therapeutics, especially for cell types not routinely accessible by biopsies. But while engineered expression of transcription factors (TFs) identified through TF screens has been found to rapidly and efficiently produce some cell types, generation of other cell types that require complex combinations of TFs has been elusive. Here we develop an iterative, pooled single-cell TF screening method that improves the identification of effective TF combinations using the generation of human microglia-like cells as a testbed: Two iterations identified a combination of SPI1, CEBPA, FLI1, MEF2C, CEBPB, and IRF8 as sufficient to differentiate human iPSC into microglia-like cells in 4 days. Characterization of TF-induced microglia demonstrated molecular and functional similarity to primary microglia. We explore the use of single-cell atlas reference datasets to confirm identified TFs and how combining single-cell TF perturbation and gene expression data can enable the construction of causal gene regulatory networks. We describe what will be needed to fashion these methods into a generalized integrated pipeline, further ideas for enhancement, and possible applications.

We present Barcoded Oligonucleotides Ligated On RNA Amplified for Multiplexed and parallel In-Situ analysis (BOLORAMIS), a reverse-transcription (RT)-free method for spatially-resolved, targeted, in-situ RNA identification of single or multiple targets. For this proof of concept, we have profiled 154 distinct coding and small non-coding transcripts ranging in sizes 18 nucleotide (nt) in length and upwards, from over 200,000 individual human induced pluripotent stem cells (iPSC) and demonstrated compatibility with multiplexed detection, enabled by fluorescent in-situ sequencing. We use BOLORAMIS data to identify differences in spatial localization and cell-to-cell expression heterogeneity. Our results demonstrate BOLORAMIS to be a generalizable toolset for targeted, in-situ detection of coding and small non-coding RNA for single or multiplexed applications.