Multiplexed RNA imaging in single cells The basis of cellular function is where and when proteins are expressed and in what quantities. Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments quantify the copy number and location of mRNA molecules; however, the numbers of RNA species that can be simultaneously measured by smFISH has been limited. Using combinatorial labeling with error-robust encoding schemes, Chen et al. simultaneously imaged 100 to 1000 RNA species in a single cell. Such large-scale detection allows regulatory interactions to be analyzed at the transcriptome scale. Science , this issue p. 10.1126/science.aaa6090

Mapping the brain, one neuron at a time Spatial transcriptomics can link molecularly described cell types to their anatomical positions and functional roles. Moffitt et al. used a combination of single-cell RNA-sequencing and MERFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) to map the identity and location of specific cell types within the mouse preoptic hypothalamus and surrounding areas of the brain (see the Perspective by Tasic and Nicovich). They related these cell types to specific behaviors via gene activity. The approach provides an unbiased description of cell types of the preoptic area, which are important for sleep, thermoregulation, thirst, and social behavior. Science , this issue p. eaau5324 ; see also p. 749

Using super-resolution imaging to directly observe the three-dimensional organization of Drosophila chromatin at a scale spanning sizes from individual genes to entire gene regulatory domains, the authors find that transcriptionally active, inactive and Polycomb-repressed chromatin states each have a distinct spatial organisation. How chromatin is folded in the nucleus has important implications for many biological processes, from the regulation of gene expression to DNA replication. Here Xiaowei Zhuang and colleagues use super-resolution imaging to directly observe the organization of Drosophila chromatin at a scale spanning the sizes of individual genes and gene regulatory domains. They find that transcriptionally active, inactive, and Polycomb-repressed chromatin states each have a distinct spatial organization. Transcriptionally inactive chromatin resembles the fractal globule state of a polymer, whereas Polycomb domains have a unique compact organization and spatial isolation from other domains, explaining why gene expression is so strongly repressed in this state. Metazoan genomes are spatially organized at multiple scales, from packaging of DNA around individual nucleosomes to segregation of whole chromosomes into distinct territories1,2,3,4,5. At the intermediate scale of kilobases to megabases, which encompasses the sizes of genes, gene clusters and regulatory domains, the three-dimensional (3D) organization of DNA is implicated in multiple gene regulatory mechanisms2,3,4,6,7,8, but understanding this organization remains a challenge. At this scale, the genome is partitioned into domains of different epigenetic states that are essential for regulating gene expression9,10,11. Here we investigate the 3D organization of chromatin in different epigenetic states using super-resolution imaging. We classified genomic domains in Drosophila cells into transcriptionally active, inactive or Polycomb-repressed states, and observed distinct chromatin organizations for each state. All three types of chromatin domains exhibit power-law scaling between their physical sizes in 3D and their domain lengths, but each type has a distinct scaling exponent. Polycomb-repressed domains show the densest packing and most intriguing chromatin folding behaviour, in which chromatin packing density increases with domain length. Distinct from the self-similar organization displayed by transcriptionally active and inactive chromatin, the Polycomb-repressed domains are characterized by a high degree of chromatin intermixing within the domain. Moreover, compared to inactive domains, Polycomb-repressed domains spatially exclude neighbouring active chromatin to a much stronger degree. Computational modelling and knockdown experiments suggest that reversible chromatin interactions mediated by Polycomb-group proteins play an important role in these unique packaging properties of the repressed chromatin. Taken together, our super-resolution images reveal distinct chromatin packaging for different epigenetic states at the kilobase-to-megabase scale, a length scale that is directly relevant to genome regulation.

Spatial organization inside the nucleus In eukaryotic cells, DNA is packaged into a complex macromolecular structure called chromatin. Wang et al. have developed an imaging method to map the position of multiple regions on individual chromosomes, and the results confirm that chromatin is organized into large contact domains called TADS (topologically associating domains). Unexpectedly, though, folding deviates from the classical fractal-globule model at large length scales. Science , this issue p. 598

Significance Image-based approaches to single-cell transcriptomics offer the ability to quantify not only the copy number of RNAs within cells but also the intracellular RNA location and the spatial organization of cells within cultures or tissues. Here we report advances in multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH) that increase the measurement throughput by two orders of magnitude and allow gene expression profiling of ∼40,000 human cells in a single 18-h measurement. This drastic increase in throughput should facilitate the identification and study of rare populations of cells as well as the characterization of transcriptionally distinct cell types within large tissue regions.

Multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease of the CNS1. Astrocytes contribute to the pathogenesis of multiple sclerosis2, but little is known about the heterogeneity of astrocytes and its regulation. Here we report the analysis of astrocytes in multiple sclerosis and its preclinical model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by single-cell RNA sequencing in combination with cell-specific Ribotag RNA profiling, assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC–seq), chromatin immunoprecipitation with sequencing (ChIP–seq), genome-wide analysis of DNA methylation and in vivo CRISPR–Cas9-based genetic perturbations. We identified astrocytes in EAE and multiple sclerosis that were characterized by decreased expression of NRF2 and increased expression of MAFG, which cooperates with MAT2α to promote DNA methylation and represses antioxidant and anti-inflammatory transcriptional programs. Granulocyte–macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) signalling in astrocytes drives the expression of MAFG and MAT2α and pro-inflammatory transcriptional modules, contributing to CNS pathology in EAE and, potentially, multiple sclerosis. Our results identify candidate therapeutic targets in multiple sclerosis. Single-cell RNA sequencing of cells from humans with multiple sclerosis and mice with a model of the disease identifies a population of disease-promoting astrocytes in which anti-oxidant and anti-inflammatory proteins are suppressed.

Significance Photoactivatable fluorescent proteins (PAFPs) are important probes for superresolution fluorescence microscopy, which allows the spatial organization of proteins in living cells to be probed with sub–diffraction-limit resolution. Here, we compare four properties of PAFPs that are critical for superresolution imaging and report two new PAFPs that exhibit excellent performance in all four properties.

Homomeric ring ATPases perform many vital and varied tasks in the cell, ranging from chromosome segregation to protein degradation. Here we report the direct observation of the intersubunit coordination and step size of such a ring ATPase, the double-stranded-DNA packaging motor in the bacteriophage ϕ29. Using high-resolution optical tweezers, we find that packaging occurs in increments of 10 base pairs (bp). Statistical analysis of the preceding dwell times reveals that multiple ATPs bind during each dwell, and application of high force reveals that these 10-bp increments are composed of four 2.5-bp steps. These results indicate that the hydrolysis cycles of the individual subunits are highly coordinated by means of a mechanism novel for ring ATPases. Furthermore, a step size that is a non-integer number of base pairs demands new models for motor–DNA interactions. Homomeric ring ATPases are found in all forms of life and are involved in many processes such as chromosome segregation, protein unfolding and ATP synthesis. This remarkable functional diversity is generated by a single, highly conserved, structural core, responsible for the binding and hydrolysis of ATP. How these enzymes coordinate ATP hydrolysis and mechanistic function is largely unknown. One such ring ATPase from a bacteriophage, ϕ29, helps load the dsDNA genome into the viral shell. Moffitt et al. show that this five-membered motor packages the DNA in 10-base-pair bursts, each consisting of four individual 2.5-bp steps corresponding to the hydrolysis of a single ATP. Such a non-integral step size is unprecedented, and raises intriguing mechanistic questions about ATP hydrolysis within rings, and the interactions of the ring with DNA. A ring ATPase from a bacteriophage, ϕ29, helps load the dsDNA genome into the viral shell. It is shown that this motor packages the DNA in 10 base pair (bp) bursts, which are composed of four individual 2.5 bp steps, each representing hydrolysis of a single ATP. Such a non-integral step size is unexpected, and raises intriguing mechanistic questions about ATP hydrolysis within rings.

Highly multiplexed single-molecule FISH has emerged as a promising approach to spatially resolved single-cell transcriptomics because of its ability to directly image and profile numerous RNA species in their native cellular context. However, background-from off-target binding of FISH probes and cellular autofluorescence-can become limiting in a number of important applications, such as increasing the degree of multiplexing, imaging shorter RNAs, and imaging tissue samples. Here, we developed a sample clearing approach for FISH measurements. We identified off-target binding of FISH probes to cellular components other than RNA, such as proteins, as a major source of background. To remove this source of background, we embedded samples in polyacrylamide, anchored RNAs to this polyacrylamide matrix, and cleared cellular proteins and lipids, which are also sources of autofluorescence. To demonstrate the efficacy of this approach, we measured the copy number of 130 RNA species in cleared samples using multiplexed error-robust FISH (MERFISH). We observed a reduction both in the background because of off-target probe binding and in the cellular autofluorescence without detectable loss in RNA. This process led to an improved detection efficiency and detection limit of MERFISH, and an increased measurement throughput via extension of MERFISH into four color channels. We further demonstrated MERFISH measurements of complex tissue samples from the mouse brain using this matrix-imprinting and -clearing approach. We envision that this method will improve the performance of a wide range of in situ hybridization-based techniques in both cell culture and tissues.

Abstract Neurons are highly polarized cells with complex neurite morphology. Spatial organization and local translation of RNAs in dendrites and axons play an important role in many neuronal functions. Here we performed super-resolution spatial profiling of RNAs inside individual neurons at the genome scale using multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH), and mapped the spatial organization of up to ∼4,200 RNA species (genes) across multiple length scales, ranging from sub-micrometer to millimeters. Our data generated a quantitative intra-neuronal atlas of RNAs with distinct transcriptome compositions in somata, dendrites, and axons, and revealed diverse sub-dendritic distribution patterns of RNAs. Moreover, our spatial analysis identified distinct groups of genes exhibiting specific spatial clustering of transcripts at the sub-micrometer scale that were dependent on protein synthesis and differentially dependent on synaptic activity. Overall, these data provide a rich resource for characterizing the subcellular organization of the transcriptome in neurons with high spatial resolution.