Abstract The current COVID-19 epidemic imposed an unpreceded challenge to the scientific community in terms of treatment, epidemiology, diagnosis, social interaction, fiscal policies and many other areas. The development of accurate and reliable diagnostic tools (high specificity and sensitivity) is crucial in the current period, the near future and in the long term. These assays should provide guidance to identify immune presumptive protected persons, potential plasma, and/or B cell donors and vaccine development among others. Also, such assays will be contributory in supporting prospective and retrospective studies to identify the prevalence and incidence of COVID-19 and to characterize the dynamics of the immune response. As of today, only thirteen serological assays have received the Emergency Use Authorization (EUA) by the U.S. Federal Drug Administration (FDA). In this work we describe the development and validation of a quantitative IgG enzyme-linked immunoassay (ELISA) using the recombinant SARS-CoV-2 Spike Protein S1 domain, containing the receptor-binding domain (RBD), showing 98% sensitivity, 98.9% specificity and positive and negative predictive values of 100% and 99.2%, respectively. The assay showed to be useful to test for SARS-CoV-2 IgG antibodies in plasma samples from COVID-19-recovered subjects as potential donors for plasmapheresis. This assay is currently under review by the Federal Drug Administration for an Emergency Use Authorization request (Submission Number EUA201115).

Abstract Increasing age is associated with dysregulated immune function and increased inflammation– patterns that are also observed in individuals exposed to chronic social adversity. Yet we still know little about how social adversity impacts the immune system and how it might promote age-related diseases. Here, we investigated how immune cell diversity varied with age, sex and social adversity (operationalized as low social status) in free-ranging rhesus macaques. We found age-related signatures of immunosenescence, including lower proportions of CD20+ B cells, CD20+/CD3+ ratio, and CD4+/CD8+ T cell ratio – all signs of diminished antibody production. Age was associated with higher proportions of CD3+/CD8+ Cytotoxic T cells, CD16+/CD3-Natural Killer cells, CD3+/CD4+/CD25+ and CD3+/CD8+/CD25+ T regulatory cells, and CD14+/CD16+/HLA-DR+ intermediate monocytes, and lower levels of CD14+/CD16-/HLA-DR+ classical monocytes, indicating greater amounts of inflammation and immune dysregulation. We also found an effect of exposure to social adversity (i.e., low social status) that was sex-dependent. High-status males, relative to females, had higher CD20+/CD3+ ratios and CD16+/CD3 Natural Killer cell proportions, and lower proportions of CD8+ Cytotoxic T cells. Further, low status females had higher proportions of cytotoxic T cells than high status females, while the opposite was observed in males. High status males had higher CD20+/CD3+ ratios than low status males. Together, our study identifies immune cell types that differ by age in a human-relevant primate model animal, and demonstrates a novel link between sex-dependent immunity and social adversity.

The role of Zika virus (ZIKV) immunity on subsequent dengue virus (DENV) infections is relevant to anticipate the dynamics of forthcoming DENV epidemics in areas with previous ZIKV exposure. We study the effect of ZIKV infection with various strains on subsequent DENV immune response after 10 and 2 months of ZIKV infection in rhesus macaques. Our results show that a subsequent DENV infection in animals with early- and middle-convalescent periods to ZIKV do not promote an increase in DENV viremia nor pro-inflammatory status. Previous ZIKV exposure increases the magnitude of the antibody and T cell responses against DENV, and different time intervals between infections alter the magnitude and durability of such responses—more after longer ZIKV pre-exposure. Collectively, we find no evidence of a detrimental effect of ZIKV immunity in a subsequent DENV infection. This supports the implementation of ZIKV vaccines that could also boost immunity against future DENV epidemics.

Abstract Dengue (DENV) virus and Zika virus (ZIKV) are two flaviviruses of major public health concern. One drawback designing effective vaccines is our limited understanding of the mechanisms ruling protection or harm among DENV serotypes, or between DENV and ZIKV. Here, we depleted rhesus macaques of CD4 + T cells in vivo before primary DENV infection and/or secondary ZIKV challenge to recreate a sub-optimal priming of the humoral immune response. Our results support that CD4 + T cells are needed to induce a quantitative and type-specific effective humoral immune response against primary DENV, but also against secondary ZIKV in DENV-experimented subjects. Our results also indicate a limited contribution of the DENV-Memory B cells to anti-ZIKV response. Furthermore, our results suggest that a suboptimal B cell priming during a primary DENV infection does differentially impact different antibody (Abs) properties. While binding or neutralization of ZIKV or DENV during a subsequent exposure to ZIKV is not affected by the lack of CD4 + T - B cells interaction during a primary DENV infection, that interaction is critical to guarantee the Abs specificity. Also, we found that depleting CD4 + T cells before DENV primary infection but not before ZIKV challenge significantly increases Abs cross-reactivity against DENV-EDIII domain and DENV-NS1 protein but not against ZIKV-EDIII domain or NS1 protein. Furthermore, there was more cross-reactivity among the DENV-NS1 proteins than against DENV-EDIII domains, suggesting that during a primary DENV infection CD4 + T cells have a different weight in the responses against EDIII domain and NS1 protein. The proper Abs binding and neutralization with increased cross-reactivity profile was associated with limited frequency of circulating peripheral T helper cells (pTfh) with T helper 1 phenotype (CD4+/CXCR5+/CXCR3+) and expressing markers related to B cell activation (CXCR5+/CXCR3+/PD-1+/ICOS+) in the group depleted of CD4 + T cells only before primary DENV infection. However, memory B cells – but not Antibody Secreting Cells (ASC) activation 7 days after the infection – positively correlate with those two populations of pTfh. Finally, when Abs cross-reactivity values were incorporated in a Principal Component Analysis (PCA), the DENV-CD4 + T depleted group separates from the other two groups with similar Abs binding and neutralization profiles. Our result strongly suggests that during a heterologous sequential DENV/ZIKV infections Abs binding, and neutralization, may be regulated by different factors than their specificity. Before, the induction of cross-neutralizing Abs has been described in the context of secondary DENV infection. Here, for the first time, we are reproducing the experimental conditions leading to the generation of such Abs population in vivo . In summary, we show that suboptimal immune priming during a primary flavivirus infection has functional consequences during a secondary heterologous infection. Finally, we shown that CD8 + T cells are essential to guarantee an optimal Abs neutralization activity. These results have huge implications understanding the immune response to DENV vaccines (and maybe ZIKV), including why an optimal vaccine or natural-induced neutralizing response not necessarily protects or enhances pathogenesis during a subsequent natural heterologous exposure.

Prior exposure to a single serotype of dengue virus (DENV) predisposes individuals to severe disease upon secondary heterologous DENV infection. Here we show that the length of time between DENV/Zika (ZIKV) infections has a qualitative impact on controlling ZIKV replication. We identified limited but significant differences in the magnitude of the early humoral immune response associated with a period of twelve months but not three months of DENV convalescence. However, their role limiting ZIKV replication is not conclusive. There was no evidence of in vivo antibody-dependent amplification of ZIKV by DENV immunity in any group. We are also showing that the significant differences among groups may be linked to a pre-existing polyfunctional CD4+ T cells response (increased IFN-g and Cd107a before ZIKV infection) and to an early and continuous expansion of the CD4+ effector memory cells early on after ZIKV infection. Those significant differences were associated with a period of 12 months after DENV infection that were not observed in a span of 3-months. These results suggest that there is a window of optimal cross-protection between ZIKV and DENV with significant consequences. These results have pivotal implications while interpreting ZIKV pathogenesis in flavivirus-experimented populations, diagnostic results interpretation and vaccine designs among others.Author Summary Since its introduction in the Americas region ZIKV virus has been associated to severe birth defects. One of the questions that remains open is the role of previous dengue or any other flavivirus immunity in the pathogenesis of ZIKV and more important, if the time elapse between DENV and ZIKV play a role enhancing ZIKV pathogenesis as it is the case for subsequent DENV infections. On this work, using NHP as a model we compared the effect of a period of 12 months vs. a period of 3 months of DENV immunity in the outcome of ZIKV infection. We found that previous DENV infection, at any of the tested period of time do not induce ZIKV enhancement. More relevant are showing that when the two infection occurs at least one year apart the preexisting DENV immunity is better at controlling ZIKV replication and that the role of the neutralizing antibodies is very limited. On the contrary our results suggest that early after ZIKV infection the cellular immune response, may plays a predominant role. Our findings have critical relevance to understand the dynamic interaction between these two flavivirus, their pathogenies, diagnosis and vaccine design.

Abstract Natural infection of SARS-CoV-2 in humans leads to the development of a strong neutralizing antibody response, however the immunodominant targets of the polyclonal neutralizing antibody response are still unknown. Here, we functionally define the role SARS-CoV-2 spike plays as a target of the human neutralizing antibody response. In this study, we identify the spike protein subunits that contain antigenic determinants and examine the neutralization capacity of polyclonal sera from a cohort of patients that tested qRT-PCR-positive for SARS-CoV-2. Using an ELISA format, we assessed binding of human sera to spike subunit 1 (S1), spike subunit 2 (S2) and the receptor binding domain (RBD) of spike. To functionally identify the key target of neutralizing antibody, we depleted sera of subunit-specific antibodies to determine the contribution of these individual subunits to the antigen-specific neutralizing antibody response. We show that epitopes within RBD are the target of a majority of the neutralizing antibodies in the human polyclonal antibody response . These data provide critical information for vaccine development and development of sensitive and specific serological testing.