Abstract Large-scale recordings of neural activity are providing new opportunities to study network-level dynamics. However, the sheer volume of data and its dynamical complexity are critical barriers to uncovering and interpreting these dynamics. Deep learning methods are a promising approach due to their ability to uncover meaningful relationships from large, complex, and noisy datasets. When applied to high-D spiking data from motor cortex (M1) during stereotyped behaviors, they offer improvements in the ability to uncover dynamics and their relation to subjects’ behaviors on a millisecond timescale. However, applying such methods to less-structured behaviors, or in brain areas that are not well-modeled by autonomous dynamics, is far more challenging, because deep learning methods often require careful hand-tuning of complex model hyperparameters (HPs). Here we demonstrate AutoLFADS, a large-scale, automated model-tuning framework that can characterize dynamics in diverse brain areas without regard to behavior. AutoLFADS uses distributed computing to train dozens of models simultaneously while using evolutionary algorithms to tune HPs in a completely unsupervised way. This enables accurate inference of dynamics out-of-the-box on a variety of datasets, including data from M1 during stereotyped and free-paced reaching, somatosensory cortex during reaching with perturbations, and frontal cortex during cognitive timing tasks. We present a cloud software package and comprehensive tutorials that enable new users to apply the method without needing dedicated computing resources.

Abstract Autism spectrum disorder (ASD) is a genetically heterogeneous disorder linked with rare, inherited and de novo mutations occurring in two main functional gene categories: gene expression regulation and synaptic function 1 . Accumulating evidence points to dysregulation in cortical neurogenesis as a convergent mechanism in ASD pathophysiology 2-8 . While asynchronous development has been identified as a shared feature among ASD-risk genes in the category of gene expression regulation, it remains unknown whether this phenotype is also associated with ASD-risk genes in the synaptic function category. Here we show for the first time the expression of the synaptic Ras GTP-ase activating protein 1 (SYNGAP1), one of the top ASD risk genes 9 , in human cortical progenitors (hCPs). Interestingly, we found that multiple components of the postsynaptic density (PSD) of excitatory synapses, of which SYNGAP1 is one of the most abundant components 10,11 , are enriched in the proteome of hCPs. Specifically, we discover that SYNGAP1 is expressed within the apical domain of human radial glia cells (hRGCs) where it lines the wall of the developing cortical ventricular zone colocalizing with the tight junction-associated protein and MAGUK family member TJP1. In a cortical organoid model of SYNGAP1 haploinsufficiency, we show dysregulated cytoskeletal dynamics that impair the scaffolding and division plane of hRGCs, resulting in disrupted lamination of the cortical plate and accelerated maturation of cortical projection neurons. Overall, the discovery of the expression and function of SYNGAP1 in cortical progenitor cells reframes our understanding of the pathophysiology of SYNGAP1-related disorders and, more broadly, underscores the importance of dissecting the role of synaptic genes associated with neurodevelopmental disorders in distinct cell types across developmental stages.

Abstract Vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) is a rare but extremely dangerous side effect that has been reported for several adenoviral (Ad)-vectored COVID-19 vaccines. VITT pathology had been linked to production of antibodies that recognize platelet factor 4 (PF4), an endogenous chemokine. In this work we characterize anti-PF4 antibodies obtained from a VITT patient’s blood. Intact-mass MS measurements indicate that a significant fraction of this ensemble is comprised of antibodies representing a limited number of clones. MS analysis of large antibody fragments (the light chain, as well as the Fc/2 and Fd fragments of the heavy chain) confirms the monoclonal nature of this component of the anti-PF4 antibodies repertoire, and reveals the presence of a fully mature complex biantennary N-glycan within its Fd segment. Peptide mapping using two complementary proteases and LC-MS/MS analysis were used to determine the amino acid sequence of the entire light chain and over 98% of the heavy chain (excluding a short N-terminal segment). The sequence analysis allows the monoclonal antibody to be assigned to IgG2 subclass and verify that the light chain belongs to the λ-type. Incorporation of enzymatic de- N -glycosylation into the peptide mapping routine allows the N -glycan in the Fab region of the antibody to be localized to the framework 3 region of the V H domain. This novel N -glycosylation site (absent in the germline sequence) is a result of a single mutation giving rise to an NDT motif in the antibody sequence. Peptide mapping also provides a wealth of information on lower-abundance proteolytic fragments derived from the polyclonal component of the anti-PF4 antibody ensemble, revealing the presence of all four subclasses (IgG1 through IgG4) and both types of the light chain (λ and κ). The structural information reported in this work will be indispensable for understanding the molecular mechanism of VITT pathogenesis.

Abstract Lymphoid tissues are an important HIV reservoir site that persists in the face of antiretroviral therapy and natural immunity. Targeting these reservoirs by harnessing the antiviral activity of local tissue resident memory ( T RM ) CD8 + T-cells is of great interest, but limited data exist on T RM s within lymph nodes of people living with HIV (PLWH). Here, we studied tonsil CD8 + T-cells obtained from PLWH and uninfected controls from South Africa. We show that these cells are preferentially located outside the germinal centers (GCs), the main reservoir site for HIV, and display a low cytolytic and transcriptionally T RM -like profile that is distinct from blood. In PLWH, CD8 + T RM -like cells are highly expanded and adopt a more cytolytic, activated and exhausted phenotype characterized by increased expression of CD69, PD-1 and perforin, but reduced CD127. This phenotype was enhanced in HIV-specific CD8 + T-cells from tonsils compared to matched blood. Single-cell profiling of these cells revealed a clear transcriptional signature of T-cell activation, clonal expansion and exhaustion ex-vivo . In contrast, this signature was absent from HIV-specific CD8 + T-cells in tonsils isolated from a natural HIV controller, who expressed lower levels of cell surface PD-1 and CXCR5, and reduced transcriptional evidence of T-cell activation, exhaustion and cytolytic activity. Thus, we show that HIV-specific T RM -like CD8 + T-cells in tonsils from non-HIV controllers are enriched for activation and exhaustion profiles compared to those in blood, suggesting that lymphoid HIV-specific CD8 + T RM cells are potentially ideal candidates for immunotherapy to modulate their ability to targeting the HIV reservoirs.

ABSTRACT Immunological priming – either in the context of prior infection or vaccination – elicits protective responses against subsequent Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) infection. However, the changes that occur in the lung cellular milieu post-primary Mtb infection and their contributions to protection upon reinfection remain poorly understood. Here, using clinical and microbiological endpoints in a non-human primate reinfection model, we demonstrate that prior Mtb infection elicits a long-lasting protective response against subsequent Mtb exposure and that the depletion of CD4 + T cells prior to Mtb rechallenge significantly abrogates this protection. Leveraging microbiologic, PET-CT, flow cytometric, and single-cell RNA-seq data from primary infection, reinfection, and reinfection-CD4 + T cell depleted granulomas, we identify differential cellular and microbial features of control. The data collectively demonstrate that the presence of CD4 + T cells in the setting of reinfection results in a reduced inflammatory lung milieu characterized by reprogrammed CD8 + T cell activity, reduced neutrophilia, and blunted type-1 immune signaling among myeloid cells, mitigating Mtb disease severity. These results open avenues for developing vaccines and therapeutics that not only target CD4 + and CD8 + T cells, but also modulate innate immune cells to limit Mtb disease.

Abstract The massive COVID-19 vaccine roll-out campaign illuminated a range of rare side effects, the most dangerous of which – vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) – is caused by adenoviral (Ad)-vectored vaccines. VITT occurrence had been linked to production of pathogenic antibodies that recognize an endogenous chemokine, platelet factor 4 (PF4). Mass spectrometry (MS)-based evaluation of the ensemble of anti-PF4 antibodies obtained from a VITT patient’s blood indicates that its major component is a monoclonal antibody. Structural characterization of this antibody reveals several unusual characteristics, such as the presence of an N -glycan in the Fab segment and high density of acidic amino acid residues in the CDR regions. A recombinant version of this antibody (RVT1) was generated by transient expression in mammalian cells based on the newly determined sequence. It captures the key properties of VITT antibodies, such as their ability to activate platelets in a PF4-dependent fashion. Homology modeling of the Fab segment reveals a well-defined polyanionic paratope, and the docking studies indicate that the polycationic segment of PF4 readily accommodates two Fab segments, cross-linking the antibodies to yield polymerized immune complexes. Their existence was verified with native MS by detecting assemblies as large as (RVT1) 3 (PF4) 2 , pointing out at FcγRIIa-mediated platelet activation as the molecular mechanism underlying VITT clinical manifestations. In addition to high PF4 affinity, RVT1 readily binds other polycationic targets, indicating a polyreactive nature of this antibody. This surprising polyspecificity not only sheds light on VITT etiology, but also opens up a range of opportunities to manage this pathology. Significance Statement Vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) is a dangerous side effect of adenoviral-vectored vaccines that is linked to the emergence of autoantibodies recognizing platelet factor 4 (PF4). We have engineered a recombinant VITT antibody by sequencing a VITT patient-derived anti-PF4 monoclonal antibody that causes platelet activation and triggers thrombosis. This antibody was used to characterize architecture of the pathogenic immune complexes with a combination of biophysical and computational approaches, revealing the molecular mechanism of VITT. The results of this work demonstrate the critical role of electrostatics in PF4 recognition by the pathogenic antibody and the polyspecificity of the latter. Availability of the engineered VITT antibody will be invaluable for future studies aiming at understanding the general mechanistic features of autoimmune pathologies.

Long-lasting confusion and memory difficulties during the postictal state remain a major unmet problem in epilepsy that lacks pathophysiological explanation and treatment. We previously identified that long-lasting periods of severe postictal hypoperfusion/hypoxia, not seizures per se , are associated with memory impairment after temporal lobe seizures. While this observation suggests a key pathophysiological role for insufficient energy delivery, it is unclear how the networks that underlie episodic memory respond to vascular constraints that ultimately give rise to amnesia. Here, we focused on cellular/network level analyses in the CA1 of hippocampus in vivo to determine if neural activity, network oscillations, synaptic transmission, and/or synaptic plasticity are impaired following kindled seizures. Importantly, the induction of severe postictal hypoperfusion/hypoxia was prevented in animals treated by a COX-2 inhibitor, which experimentally separated seizures from their vascular consequences. We observed complete activation of CA1 pyramidal neurons during brief seizures, followed by a short period of reduced activity and flattening of the local field potential that resolved within minutes. During the postictal state, constituting tens of minutes to hours, we observed no changes in neural activity, network oscillations, and synaptic transmission. However, long-term potentiation of the temporoammonic pathway to CA1 was impaired in the postictal period, but only when severe local hypoxia occurred. Lastly, we tested the ability of rats to perform object-context discrimination, which has been proposed to require temporoammonic input to differentiate between sensory experience and the stored representation of the expected object-context pairing. Deficits in this task following seizures were reversed by COX-2 inhibition, which prevented severe postictal hypoxia. These results support a key role for hypoperfusion/hypoxia in postictal memory impairments and identify that many aspects of hippocampal network function are resilient during severe hypoxia except for long-term synaptic plasticity.