Metagenomic next-generation sequencing (NGS) of cerebrospinal fluid (CSF) has the potential to identify a broad range of pathogens in a single test.In a 1-year, multicenter, prospective study, we investigated the usefulness of metagenomic NGS of CSF for the diagnosis of infectious meningitis and encephalitis in hospitalized patients. All positive tests for pathogens on metagenomic NGS were confirmed by orthogonal laboratory testing. Physician feedback was elicited by teleconferences with a clinical microbial sequencing board and by surveys. Clinical effect was evaluated by retrospective chart review.We enrolled 204 pediatric and adult patients at eight hospitals. Patients were severely ill: 48.5% had been admitted to the intensive care unit, and the 30-day mortality among all study patients was 11.3%. A total of 58 infections of the nervous system were diagnosed in 57 patients (27.9%). Among these 58 infections, metagenomic NGS identified 13 (22%) that were not identified by clinical testing at the source hospital. Among the remaining 45 infections (78%), metagenomic NGS made concurrent diagnoses in 19. Of the 26 infections not identified by metagenomic NGS, 11 were diagnosed by serologic testing only, 7 were diagnosed from tissue samples other than CSF, and 8 were negative on metagenomic NGS owing to low titers of pathogens in CSF. A total of 8 of 13 diagnoses made solely by metagenomic NGS had a likely clinical effect, with 7 of 13 guiding treatment.Routine microbiologic testing is often insufficient to detect all neuroinvasive pathogens. In this study, metagenomic NGS of CSF obtained from patients with meningitis or encephalitis improved diagnosis of neurologic infections and provided actionable information in some cases. (Funded by the National Institutes of Health and others; PDAID ClinicalTrials.gov number, NCT02910037.).

The December 2019 outbreak of a novel respiratory virus, SARS-CoV-2, has become an ongoing global pandemic due in part to the challenge of identifying symptomatic, asymptomatic, and pre-symptomatic carriers of the virus. CRISPR diagnostics can augment gold-standard PCR-based testing if they can be made rapid, portable, and accurate. Here, we report the development of an amplification-free CRISPR-Cas13a assay for direct detection of SARS-CoV-2 from nasal swab RNA that can be read with a mobile phone microscope. The assay achieved ∼100 copies/μL sensitivity in under 30 min of measurement time and accurately detected pre-extracted RNA from a set of positive clinical samples in under 5 min. We combined crRNAs targeting SARS-CoV-2 RNA to improve sensitivity and specificity and directly quantified viral load using enzyme kinetics. Integrated with a reader device based on a mobile phone, this assay has the potential to enable rapid, low-cost, point-of-care screening for SARS-CoV-2.

Ferroportin (Fpn) is the only known iron exporter in vertebrates. Hepcidin, a peptide secreted by the liver in response to iron or inflammation, binds to Fpn, inducing its internalization and degradation. We show that after binding of hepcidin, Fpn is tyrosine phosphorylated at the plasma membrane. Mutants of human Fpn that do not get internalized or that are internalized slowly show either absent or impaired phosphorylation. We identify adjacent tyrosines as the phosphorylation sites and show that mutation of both tyrosines prevents hepcidin-mediated Fpn internalization. Once internalized, Fpn is dephosphorylated and subsequently ubiquitinated. An inability to ubiquitinate Fpn does not prevent hepcidin-induced internalization, but it inhibits the degradation of Fpn. Ubiquitinated Fpn is trafficked through the multivesicular body pathway en route to degradation in the late endosome/lysosome. Depletion of proteins involved in multivesicular body trafficking (Endosome Sorting Complex Required for Transport proteins), by small-interfering RNA, reduces the trafficking of Fpn-green fluorescent to the lysosome.

Lower respiratory tract infections (LRTIs) lead to more deaths each year than any other infectious disease category. Despite this, etiologic LRTI pathogens are infrequently identified due to limitations of existing microbiologic tests. In critically ill patients, noninfectious inflammatory syndromes resembling LRTIs further complicate diagnosis. To address the need for improved LRTI diagnostics, we performed metagenomic next-generation sequencing (mNGS) on tracheal aspirates from 92 adults with acute respiratory failure and simultaneously assessed pathogens, the airway microbiome, and the host transcriptome. To differentiate pathogens from respiratory commensals, we developed a rules-based model (RBM) and logistic regression model (LRM) in a derivation cohort of 20 patients with LRTIs or noninfectious acute respiratory illnesses. When tested in an independent validation cohort of 24 patients, both models achieved accuracies of 95.5%. We next developed pathogen, microbiome diversity, and host gene expression metrics to identify LRTI-positive patients and differentiate them from critically ill controls with noninfectious acute respiratory illnesses. When tested in the validation cohort, the pathogen metric performed with an area under the receiver-operating curve (AUC) of 0.96 (95% CI, 0.86–1.00), the diversity metric with an AUC of 0.80 (95% CI, 0.63–0.98), and the host transcriptional classifier with an AUC of 0.88 (95% CI, 0.75–1.00). Combining these achieved a negative predictive value of 100%. This study suggests that a single streamlined protocol offering an integrated genomic portrait of pathogen, microbiome, and host transcriptome may hold promise as a tool for LRTI diagnosis.

Importance

 Identifying infectious causes of subacute or chronic meningitis can be challenging. Enhanced, unbiased diagnostic approaches are needed. 

Objective

 To present a case series of patients with diagnostically challenging subacute or chronic meningitis using metagenomic next-generation sequencing (mNGS) of cerebrospinal fluid (CSF) supported by a statistical framework generated from mNGS of control samples from the environment and from patients who were noninfectious. 

Design, Setting, and Participants

 In this case series, mNGS data obtained from the CSF of 94 patients with noninfectious neuroinflammatory disorders and from 24 water and reagent control samples were used to develop and implement a weighted scoring metric based onzscores at the species and genus levels for both nucleotide and protein alignments to prioritize and rank the mNGS results. Total RNA was extracted for mNGS from the CSF of 7 participants with subacute or chronic meningitis who were recruited between September 2013 and March 2017 as part of a multicenter study of mNGS pathogen discovery among patients with suspected neuroinflammatory conditions. The neurologic infections identified by mNGS in these 7 participants represented a diverse array of pathogens. The patients were referred from the University of California, San Francisco Medical Center (n = 2), Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Center (n = 2), Cleveland Clinic (n = 1), University of Washington (n = 1), and Kaiser Permanente (n = 1). A weightedzscore was used to filter out environmental contaminants and facilitate efficient data triage and analysis. 

Main Outcomes and Measures

 Pathogens identified by mNGS and the ability of a statistical model to prioritize, rank, and simplify mNGS results. 

Results

 The 7 participants ranged in age from 10 to 55 years, and 3 (43%) were female. A parasitic worm (Taenia solium, in 2 participants), a virus (HIV-1), and 4 fungi (Cryptococcus neoformans,Aspergillus oryzae,Histoplasma capsulatum, andCandida dubliniensis) were identified among the 7 participants by using mNGS. Evaluating mNGS data with a weightedzscore–based scoring algorithm reduced the reported microbial taxa by a mean of 87% (range, 41%-99%) when taxa with a combined score of 0 or less were removed, effectively separating bona fide pathogen sequences from spurious environmental sequences so that, in each case, the causative pathogen was found within the top 2 scoring microbes identified using the algorithm. 

Conclusions and Relevance

 Diverse microbial pathogens were identified by mNGS in the CSF of patients with diagnostically challenging subacute or chronic meningitis, including a case of subarachnoid neurocysticercosis that defied diagnosis for 1 year, the first reported case of CNS vasculitis caused byAspergillus oryzae, and the fourth reported case ofC dubliniensismeningitis. Prioritizing metagenomic data with a scoring algorithm greatly clarified data interpretation and highlighted the problem of attributing biological significance to organisms present in control samples used for metagenomic sequencing studies.

Although infection with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has pleiotropic and systemic effects in some individuals1-3, many others experience milder symptoms. Here, to gain a more comprehensive understanding of the distinction between severe and mild phenotypes in the pathology of coronavirus disease 2019 (COVID-19) and its origins, we performed a whole-blood-preserving single-cell analysis protocol to integrate contributions from all major immune cell types of the blood-including neutrophils, monocytes, platelets, lymphocytes and the contents of the serum. Patients with mild COVID-19 exhibit a coordinated pattern of expression of interferon-stimulated genes (ISGs)3 across every cell population, whereas these ISG-expressing cells are systemically absent in patients with severe disease. Paradoxically, individuals with severe COVID-19 produce very high titres of anti-SARS-CoV-2 antibodies and have a lower viral load compared to individuals with mild disease. Examination of the serum from patients with severe COVID-19 shows that these patients uniquely produce antibodies that functionally block the production of the ISG-expressing cells associated with mild disease, by activating conserved signalling circuits that dampen cellular responses to interferons. Overzealous antibody responses pit the immune system against itself in many patients with COVID-19, and perhaps also in individuals with other viral infections. Our findings reveal potential targets for immunotherapies in patients with severe COVID-19 to re-engage viral defence.

Since the beginning of the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic, there has been increasing urgency to identify pathophysiological characteristics leading to severe clinical course in patients infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Human leukocyte antigen alleles (HLA) have been suggested as potential genetic host factors that affect individual immune response to SARS-CoV-2. We sought to evaluate this hypothesis by conducting a multicenter study using HLA sequencing.We analyzed the association between COVID-19 severity and HLAs in 435 individuals from Germany (n = 135), Spain (n = 133), Switzerland (n = 20) and the United States (n = 147), who had been enrolled from March 2020 to August 2020. This study included patients older than 18 years, diagnosed with COVID-19 and representing the full spectrum of the disease. Finally, we tested our results by meta-analysing data from prior genome-wide association studies (GWAS).We describe a potential association of HLA-C*04:01 with severe clinical course of COVID-19. Carriers of HLA-C*04:01 had twice the risk of intubation when infected with SARS-CoV-2 (risk ratio 1.5 [95% CI 1.1-2.1], odds ratio 3.5 [95% CI 1.9-6.6], adjusted p-value = 0.0074). These findings are based on data from four countries and corroborated by independent results from GWAS. Our findings are biologically plausible, as HLA-C*04:01 has fewer predicted bindings sites for relevant SARS-CoV-2 peptides compared to other HLA alleles.HLA-C*04:01 carrier state is associated with severe clinical course in SARS-CoV-2. Our findings suggest that HLA class I alleles have a relevant role in immune defense against SARS-CoV-2.Funded by Roche Sequencing Solutions, Inc.

Abstract Type I interferon (IFN-I) neutralizing autoantibodies have been found in some critical COVID-19 patients; however, their prevalence and longitudinal dynamics across the disease severity scale, and functional effects on circulating leukocytes remain unknown. Here, in 284 COVID-19 patients, we found IFN-I autoantibodies in 19% of critical, 6% of severe and none of the moderate cases. Longitudinal profiling of over 600,000 peripheral blood mononuclear cells using multiplexed single-cell epitope and transcriptome sequencing from 54 COVID-19 patients, 15 non-COVID-19 patients and 11 non-hospitalized healthy controls, revealed a lack of IFN-I stimulated gene (ISG-I) response in myeloid cells from critical cases, including those producing anti-IFN-I autoantibodies. Moreover, surface protein analysis showed an inverse correlation of the inhibitory receptor LAIR-1 with ISG-I expression response early in the disease course. This aberrant ISG-I response in critical patients with and without IFN-I autoantibodies, supports a unifying model for disease pathogenesis involving ISG-I suppression via convergent mechanisms.

ABSTRACT Lower respiratory tract infections (LRTI) lead to more deaths each year than any other infectious disease category(1). Despite this, etiologic LRTI pathogens are infrequently identified due to limitations of existing microbiologic tests(2). In critically ill patients, non-infectious inflammatory syndromes resembling LRTI further complicate diagnosis. To address the need for improved LRTI diagnostics, we performed metagenomic next-generation sequencing (mNGS) on tracheal aspirates from 92 adults with acute respiratory failure and simultaneously assessed pathogens, the lung microbiome and the host transcriptome. To differentiate pathogens from respiratory commensals, we developed rules-based and logistic regression models (RBM, LRM) in a derivation cohort of 20 patients with LRTI or non-infectious acute respiratory illnesses. When tested in an independent validation cohort of 24 patients, both models achieved accuracies of 95.5%. We next developed pathogen, microbiome diversity, and host gene expression metrics to identify LRTI-positive patients and differentiate them from critically ill controls with non-infectious acute respiratory illnesses. When tested in the validation cohort, the pathogen metric performed with an AUC of 0.96 (95% CI = 0.86 - 1.00), the diversity metric with an AUC of 0.80 (95% CI = 0.63 – 0.98), and the host transcriptional classifier with an AUC of 0.91 (95% CI = 0.80 – 1.00). Combining all three achieved an AUC of 0.99 (95% CI = 0.97 – 1.00) and negative predictive value of 100%. This study suggests that a single streamlined protocol offering an integrated genomic portrait of pathogen, microbiome and host transcriptome may hold promise as a novel tool for LRTI diagnosis. SIGNIFICANCE STATEMENT Lower respiratory tract infections (LRTI) are the leading cause of infectious disease-related death worldwide yet remain challenging to diagnose because of limitations in existing microbiologic tests. In critically ill patients, non-infectious respiratory syndromes that resemble LRTI further complicate diagnosis and confound targeted treatment. To address this, we developed a novel metagenomic sequencing-based approach that simultaneously interrogates three core elements of acute airway infections: the pathogen, lung microbiome and host response. We studied this approach in a prospective cohort of critically ill patients with acute respiratory failure and found that combining pathogen, microbiome and host gene expression metrics achieved accurate LRTI diagnosis and identified etiologic pathogens in patients with clinically identified infections but otherwise negative testing. Funding NHLBI K12HL119997 (Langelier C), NHLBI K23HL123778 (Christensen S), NIAID P01AI091575 and the Chan Zuckerberg Biohub (DeRisi JL), NHLBI K23 HL136844 (Moazed F), NHLBI R01HL110969, K24HL133390, R35HL140026 (Calfee C), Gladstone Institutes (Pollard KS).

SARS coronavirus-2 (SARS-CoV-2) is causing a global pandemic with large variation in COVID-19 disease spectrum. SARS-CoV-2 infection requires host receptor ACE2 on lung epithelium, but epithelial underpinnings of variation are largely unknown. We capitalized on comprehensive organoid assays to report remarkable variation in SARS-CoV-2 infection rates of lung organoids from different subjects. Tropism is highest for TUBA- and MUC5AC-positive organoid cells, but levels of TUBA-, MUC5A-, or ACE2- positive cells do not predict infection rate. We identify surface molecule Tetraspanin 8 (TSPAN8) as novel mediator of SARS-CoV-2 infection, which is not downregulated by this specific virus. TSPAN8 levels, prior to infection, strongly correlate with infection rate and TSPAN8-blocking antibodies diminish SARS-CoV-2 infection. We propose TSPAN8 as novel functional biomarker and potential therapeutic target for COVID-19.